嗜水气单胞菌322A的外膜蛋白及其抗原性

用十二烷基肌氨酸钠抽提结合超速离心的方法提取一株日本鳗鲡致病性嗜水气单胞菌322A和其他4株气单胞菌标准菌株的外膜蛋白(Omp);通过SDS-PAGE分析比较这5株气单胞菌Omp的组成.结果表明,5株气单胞菌的Omp电泳可得到5-13条条带,其分子质量主要集中在20-50 ku之间,且28 ku的Omp为5株气单胞菌所共有.用罗非鱼感染322A全菌后的恢复期血清进行蛋白质印迹试验的结果显示,322A的Omp条带中有4条发生阳性反应,其分子质量分别为28、37、43和45 ku.用兔抗322A Omp的血清进行蛋白质印迹试验的结果显示,322A的Omp条带中有5条发生阳性反应,其分子质量分别为28、33、37、43和45 ku.不同抗血清的印迹结果提示了322A数条主要Omp具有免疫原性,有望成为疫苗研发的候选材料.     

嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱多样性研究

对采集自江苏、河南、福建等地淡水养殖区域的105株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了基因分型,并探讨嗜水气单胞菌的基因型与区域分布及生态位的关联性。该实验以ERIC-PCR技术进行分型,应用Quantity one 4.6对电泳图谱进行分析,采用非加权配对法(UPGMA法)做遗传分析的树状图。结果表明,105株嗜水气单胞菌可分为28个基因型。其中,XV基因型的菌株相对最多,Ⅳ、Ⅺ、ⅩⅫ、ⅩⅩⅤ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ和ⅩⅩⅧ基因型的菌株相对最少。生态位背景来源相似的菌株有聚类趋势。此外,不同地域、不同生态位的嗜水气单胞菌也可能聚为同一种基因型。由此推断嗜水气单胞菌的基因型可能与生态位及地理位置有一定的关联性。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182的原核表达、纯化与免疫原性研究

为探究嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA1182的免疫原性,依据AHA1182氨基酸序列,采用生物信息学分析嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、简氏气单胞菌、多样气单胞菌、舒氏气单胞菌、产碱普罗维登斯菌以及爱德华氏菌之间的亲缘关系;构建AHA1182原核表达菌株并确定最佳诱导表达条件;采用包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化方法获得AHA1182蛋白并免疫红鲫;利用Western blot检测红鲫抗AHA1182蛋白血清的特异性与效价;采用酶联免疫吸附(ELISA)法模拟红鲫抗AHA1182蛋白抗体血清与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用;通过测定酸性、碱性磷酸酶(ACP、AKP)活性与细胞吞噬作用,评价非特异性免疫;利用组织病理学切片探究AHA1182蛋白免疫对红鲫内脏的影响。结果显示,AHA1182蛋白家族在不同菌株间均具有亲缘性,尤其在气单胞菌间亲缘关系较近,由此推测,AHA1182蛋白抗血清具有交叉免疫保护作用;成功克隆、表达、纯化AHA1182,最佳诱导条件：菌液浓度OD₆₀₀=1.0,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,在28℃条件下诱导8 h;红鲫AHA1182蛋白抗...     

7种二氧化氯制剂对嗜水气单胞菌的杀灭效果比较研究

以嗜水气单胞菌为试验菌株,研究了7种不同生产厂家和同一厂家不同生产批次的稳定性一元二氧化氯对嗜水气单胞菌的杀灭效果.结果表明,该7批次产品对嗜水气单胞菌均有不同程度的杀灭作用,浓度越高,杀菌效果越好.不同生产厂家的二氧化氯杀菌效果参差不齐,以1,3,5,7号厂家二氧化氯杀菌效果最好,而2,4号厂家产品效果最差.且对嗜水气单胞菌的杀菌效果不受距离出厂日期的长短影响.     

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的原核表达及抗原性分析

探究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的免疫原性与抗原性,评价其免疫学功能,以期为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的开发提供理论依据.采用生物信息学方法预测TolC蛋白的理化性质,分析其菌属间同源性与进化关系,构建TolC蛋白表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化TolC蛋白,免疫小鼠制备T...     

鲤鱼细菌性败血症及穿孔病病原菌与嗜水气单胞菌标准株特性的比较研究

从发病渔场分离的鲤鱼细菌性败血病S - 1、S - 2致病菌株 ,鲤鱼穿孔病S - 3、S - 4致病菌株 ,与嗜水气单胞菌标准株作为对照 ,进行人工感染试验对健康鲤鱼具有很强的致病力 ,出现与自然病鲤相似的症状 ,并从人工感染发病鱼体内分离出同样特性的菌株 ,通过菌体形态 ,培养特性和生化反应等测定 ,符合嗜水气单胞菌的特性 ,并与嗜水气单胞菌标准株作平行试验 ,结果一致 ,确定鲤鱼细菌性败血症和穿孔病均是同一病原 ,均属嗜水气单胞菌     

铁对嗜水气单胞菌毒力因子的影响

用含不同浓度铁离子的培养基培养嗜水气单胞菌Ｊ－１株,３６ｈ时检测细菌含量以及毒素、蛋白酶、载铁体的表达量。发现菌液的浓度随着Ｆｅ２＋浓度的升高而升高,而毒力因子的表达量则相反,当Ｆｅ２＋的加入浓度为０时,毒素、蛋白酶、载铁体的表达量达最大值。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及免疫转印分析细菌的外膜蛋白（ＯＭＰ）,嗜水气单胞菌Ｊ－１株在表达载铁体的同时多表达一条ＯＭＰ,其相对分子质量为７１．７×１０３,应为载铁体的受体。此时,经ＥＬＩＳＡ检测细菌菌体及抽取物Ｓ蛋白为阴性;经超薄切片电镜观察,菌体无Ｓ层结构。随着铁离子浓度的降低,Ｊ－１株毒素、蛋白酶及载铁体的表达增多,菌体Ｓ蛋白消失,并产生相应的ＯＭＰ条带,显示铁对嗜水气单胞菌毒力因子的产生具有重要影响。     

鳊鱼出血病嗜水气单胞菌的分离·鉴定与ERIC-PCR指纹图谱研究

[目的]对鳊鱼嗜水气单胞菌进行分离与鉴定。[方法]从鳊鱼中分离出嗜水气单胞菌,并进行16S rDNA特异性分子鉴定。分析嗜水气单胞菌的生化特征,并构建嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱。[结果]分离株的测序结果与GenBank中嗜水气单胞菌的标准菌株序列相似度达98%～99%。分离菌的生化特征结果均呈阳性。同一菌株的ERIC-PCR具有较好的重复性和稳定性,可用于嗜水气单胞菌的分型溯源。[结论]该研究为预防和控制鳊鱼出血病的发生和蔓延提供了参考。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段（去除信号肽）全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T细胞（Th）抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。     

创伤弧菌外膜蛋白的分离及其抗原性分析

分别采用Sarkosyl和PMSF法分离、提取鳗源创伤弧菌FJ03-X2的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE和Western-blotting分析比较两种方法提取的外膜蛋白的组分和抗原性。SDS-PAGE分析结果表明,Sarkosyl法分离的主要外膜蛋白分子量集中在14～66 kDa之间;而PMSF法分离的主要外膜蛋白分子量分布在14～92 kDa之间。在两种方法中,分子量38 kDa、36 kDa的外膜蛋白均为高丰度蛋白。两种方法提取的创伤弧菌外膜蛋白经SDS-PAGE后,用兔抗创伤弧菌FJ03-X2血清进行Western-blotting,结果显示,兔抗FJ03-X2高免血清能识别绝大多数外膜蛋白组分,说明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中,分子量分别为66kDa、47 kDa、44 kDa、38 kDa、36 kDa、34 kDa的外膜蛋白呈强阳性反应,是主要的免疫原组分。同时,经比较分析认为PMSF法提取创伤弧菌外膜蛋白的效果更好。     

尼罗罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫反应

将嗜水气单胞菌用福尔马林灭活后,接种尼罗罗非鱼,测定其血清凝集抗体效价及攻毒后的免疫保护力。结果表明,灭活菌苗对尼罗罗非鱼有较强的免疫原性,免疫鱼具有很强的免疫保护力。小个体鱼的浸浴接种效果强于大个体。     

翘嘴鳜细菌性败血症病原菌的分离及其致病力的研究

从患细菌性败血症的翘嘴鳜病鱼中分离到１１个菌株，通过直接荧光抗体法鉴定、菌株致病力测试和生化特性分析，证实了翘嘴鳜细菌性败血症是由嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）引起的。     

乌贼墨中多酚氧化酶的分离及纯化

用pH7.2磷酸提取缓冲液从乌贼墨汁澡提取多酚氧化酶，提取的粗酶液经30%-80%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-SepharoseCL-6B柱层析和SephadexG-150柱层析后，得到纯化的多酚氧化酶，纯化们数为10.78，纯化后的酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别采用银染色和多酚氧化酶活性染色均显示一条电泳带。     

乌贼墨中多酚氧化酶的分离及纯化

用pH7.2磷酸提取缓冲液从乌贼墨汁澡提取多酚氧化酶，提取的粗酶液经30%-80%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-SepharoseCL-6B柱层析和SephadexG-150柱层析后，得到纯化的多酚氧化酶，纯化们数为10.78，纯化后的酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别采用银染色和多酚氧化酶活性染色均显示一条电泳带。     

银染聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系的优化

【目的】针对银染PAGE实验中常出现的背景颜色深、条带弥散、凝胶变形及条带不整齐等问题进行归纳总结并提出优化方法。【方法】以甘蓝型油菜基因组DNA为研究对象,通过PAGE电泳后银染并调整试剂配方、实验条件,筛选出适合实验的技术体系。【结果】甲醇浓度、电压稳定性、电泳温度、气泡等显著影响实验结果。甲醛浓度过高(1.25%)时,虽所需染色时间短,但凝胶背景深;甲醛浓度过低(0.001 25%)时,背景浅但条带淡,需要长时间染色;电压不稳定会造成条带弥散;电泳温度过高,导致凝胶变形,条带弯曲;凝胶中的气泡会扰乱DNA条带的形状;NaOH浓度在0.875%~1.375%,染色结果无明显差异。【结论】甲醛用量4 mL(1%)、保持稳定电压、在冰浴中电泳、制胶时及时赶走所有气泡,可得到凝胶背景浅、条带清晰且正常的结果。     

桑叶超氧化物歧化酶的提纯和性质的研究

桑叶超氧化物歧化酶能抑制肾上腺素的自动氧化和三氯硝基四氮唑蓝的光化还原,可以根据ＳＯＤ对肾上腺素的自动氧化的抑制作用为酶活性的定量测定。桑叶ＳＯＤ活性能被ＫＣＮ抑制但不受氯仿－乙醇影响,在表明桑叶ＳＯＤ为Ｃｕ－ＺｎＳＯＤ。它的粗提液经聚丙烯酰胺凝胶电泳及ＮＢＴ的酶活性染色,在蓝色背景上有两条无色透明的同工酶谱带。桑叶粗提液经纯化比活提高２．７倍,其分子量为３５０００,纯化后的桑叶ＳＯＤ有同样的光吸     

菊芋凝集素的分离鉴定及菊芋蛋白促进家兔离体回肠蠕动的研究

经过研磨、抽提、(NH4)2SO4沉淀后得到蛋白粗提物,通过离子交换和凝胶过滤色谱对该凝集素进行了提纯。在加入和不加入2-巯基乙醇条件下,菊芋凝集素相对分子量均约为17.6 kDa;基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)检测分子量为15.379 kDa。该凝集素可以凝集兔红血球,同时也对胰蛋白酶消化过的兔红血球有凝集作用;该凝集素为Ca2 依赖型,50℃以上其凝血活力显著下降;肝素、粘蛋白和清蛋白可以抑制该凝集素的凝血活性。在家兔离体回肠试验中,胰蛋白酶裂解粗蛋白产物使平均振幅增加25%左右,胃蛋白酶裂解粗蛋白产物使平均振幅增加20%左右。试验得到的菊芋凝集素理化性质与已知的菊芋凝集素差别很大;菊芋蛋白能够促进家兔离体回肠的蠕动,酶解后的蛋白作用更强烈。     

双孢蘑菇2796凝集素的提取及其部分理化性质研究

双孢蘑菇2796的子实体经PBS浸提、40％～60％饱和度的硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化得到双孢蘑菇2796凝集素.双孢蘑菇2796凝集素经SDS-PAGE检测为单一条带,测得亚基相对分子质量为15.7 kD,通过Sephadex...     

核盘菌不同水平抗药性菌株可溶性蛋白和酸酶的电泳图谱比较研究

为寻找到快捷有效的生理生化抗药性检测方法,对供试的6株对速克灵具有不同抗性水平的核盘菌进行了可溶性蛋白和酯酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带的试验研究。结果表明:不同抗性水平的菌株间蛋白质及酯酶图谱存在明显差异,中抗菌株与敏感菌株可溶性蛋白的主带基本一致,但中抗菌株的带数略多于敏感菌株,Rf=0.14,Rf=0.53两条带为中抗菌株所拥有,而敏感菌株不具有,高抗菌株的谱带数又显著少于敏感菌株,Rf=0.53的谱带为抗性菌株所特有。酯酶电泳图谱中敏感菌株与抗性菌株均存在特异性酶带,敏感菌株在Rf=0.20处有一条主酶带是抗性菌株所没有的,Rf=0.22的主酶带则为抗性菌株中所特有而敏感菌株没有的。因此,认为Rf=0.20的酯酶带与核盘菌的抗药性有一定相关性。     

Antimicrobial Susceptibility and Characterization of Outer Membrane Proteins of Aeromonas hydrophila Isolated in China

Aeromonas hydrophila isolates from clinical cases （n=43） were tested against 8 antimicrobial agents and typed by outer membrane protein （OMP） pattern by using sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. All isolates were resistant to ampicillin （MICs, ≥16 μg mL-1） and sulfamonomethoxine （MICs≥64 μg mLl）, but susceptible to norfloxacin （MICs,≤0.5 μg mL-1）. There was a high incidence of resistance to erythromycin （90.70%） and tylosin （93.02%）, while a low incidences of resistance to ciprofloxacin （2.33%）, enrofloxacin （2.33%） and florfenicol （4.65%）. Six different outer membrane protein patterns were found among 34 isolates by analyzing proteins in the range of 22 to 50 kDa, other than 9 isolates with their respective profiles. The strains with the similar OMP profiles had similar resistances. Compared with the other strains from the same OMP patterns, NB-1, A.Pun and MR-1 had lacked the proteins in the range of 30 to 45 kDa and their resistance to florfenicol substantially increased. It is speculated that the outer membrane protein changes might correlate with decreased susceptibility to florfenicol in the three strains. Some strains which showed completely identical OMP types had a little difference in their resistance to fluoroquinolones, indicating that there might be other factors that were involved in the antimicrobial resistance of A. hydrophila.