水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)原核表达及编码产物生物信息学分析

 据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁（55.6%）,信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键（第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸）。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复（LRR）结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgipl)原核表达及编码产物生物信息学分析

据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁(55.6%),信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键(第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸)。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复(LRR)结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

水稻抗感纹枯病品种Ospgip1基因的表达特征

 从水稻基因组DNA中扩增出1 184 bp的Ospgip1基因片段。该片段包含930 bp的完整开放阅读框,终止密码子为TAA,无内含子。RT PCR结果表明,Ospgip1基因在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但不同生育期、不同部位表达量有差异。实时PCR结果显示,抗病品种YSBR1和中感品种Jasmine 85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont;稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达量均显著提高;纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。     

Prokaryotic Expression, Purification and Characterization of a Novel Rice Seed Lipoxygenase Gene OsLOX1

Lipoxygenase (LOX, EC1.13.11.12) is a key enzyme during the degradation of lipids in animals and even plants, and also the first key enzyme responsible for the biosynthesis of jasmonate. To purify and characterize the OsLOX1 gene from rice seeds, the entire coding region of the OsLOX1 gene was inserted into an expression vector pET30a(+) and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). Expression of the fusion protein was successfully induced by isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside (IPTG) and the purified ...     

水稻种子脂氧合酶基因OsLOX1的原核表达、纯化及鉴定

脂氧合酶是动植物体内催化脂质降解的关键酶,也是茉莉酸合成途径的第一个关键酶。以先前克隆到的水稻种子脂氧合酶基因OsLOX1全长cDNA为模板,用含有特异酶切位点的P1、P2为引物,通过PCR方法将它构建到大肠杆菌表达载体pET30a(+)上并转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）中,获得相应的重组工程菌。经过20℃条件下的IPTG诱导,OsLOX1重组蛋白在BL21（DE3）菌株中得到表达,经生化特性分析,发现该重组蛋白具有LOX催化活性,其最适pH和温度分别为4.8和30℃。该重组子可进一步应用于体外生产茉莉酸和研究植物种子LOX结构与功能的关系。     

Prokaryotic Expression,Purification and Characterization of a Novel Rice Seed L.ipoxygenase Gene OsLOX1

Lipoxygenase （LOX, EC1.13.11.12） is a key enzyme during the degradation of lipids in animals and even plants, and also the first key enzyme responsible for the biosynthesis of jasmonate. To purify and characterize the OsLOX1 gene from rice seeds, the entire coding region of the OsLOX1 gene was inserted into an expression vector pET30a（＋） and transformed into Escherichia coil BL21 （DE3）. Expression of the fusion protein was successfully induced by isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside （IPTG） and the purified recombinant protein was obtained by His.Bind Kits. Further assay showed that the purified recombinant protein exhibited the LOX activity. The optimum pH was 4.8 （acetate buffer） and the optimum temperature was 30℃ for the above enzyme. Thus, the recombinant might confer an available usage for the synthesis of jasmonate in vitro, and also provides a possibility for elucidating the inter-relationship between the primary structure of the plant seed lipoxygenase protein and its physiological functions.     

茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析及原核表达

通过PCR方法扩增出迎霜品种茶多酚氧化酶（PPO）的编码区序列,并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。生物信息学分析表明,该基因编码区全长1800bp,编码599个氨基酸,分子式为C₃₀₀₈H₄₆₇₇N₈₁₃O₉₀₀S₁₈,存在两个铜离子结合域,没有跨膜区;进化树分析表明,茶与毛叶茶亲缘关系最近。成功构建了原核表达载体pET-ppo,并转化E. coli BL21（DE3）,实现了PPO的原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。     

橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。     

水稻抗白叶枯病基因xa5的原核表达及蛋白纯化

水稻是重要的粮食作物,其产量高低与病虫害等因素密切相关,由黄单胞杆菌引起的水稻白叶枯病是导致水稻产量减少的主要病害之一。控制白叶枯病最安全、经济有效的方法是培育抗病品种,隐性抗病基因xa5是重要的水稻白叶枯病抗性基因。通过构建显性及隐性xa5基因的原核表达载体(PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5),转化大肠杆菌BL21,经0.2 mmol/L IPTG 28℃ 诱导4 h,表达显性Xa5和隐性xa5蛋白;结合western-blotting分析,结果表明表达的蛋白是带有GST标签的融合蛋白,最后利用谷胱甘肽亲和层析柱将蛋白纯化,为后期研究xa5基因的功能提供基础。     

水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的克隆及表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内信号转导的重要组分,受多种生物及非生物胁迫的刺激活化。利用RT-PCR方法克隆了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的cDNA序列(GenBank登录号为GQ265780)。该序列全长1660bp,包含1个1629bp的开放阅读框,编码蛋白由542个氨基酸组成,包含典型的蛋白激酶结构域及磷酸化位点TDY基序。序列比对和分析显示,OsMPK14基因位于水稻第5染色体上,其编码区由9个外显子和8个内含子组成。采用半定量RT-PCR技术,检测了光照、低温、高盐、干旱和脱落酸对该基因在水稻地上部分和根中表达的影响。结果显示高盐、低温、脱落酸都能上调其表达,而干旱对其表达具有微弱的抑制效应,光照可以降低该基因在水稻地上部分的表达,提高在根中的表达。基因可能在水稻非生物胁迫的应答中具有重要作用,其表达受多种因素调控。     

Cloning and Expression Analysis of a Mitogen-Activated Protein Kinase Gene OsMPK14 in Rice

Mitogen activated-protein kinases(MAPKs)are important components in signal transduction pathways responding to various biotic and abiotic stresses.An MAPK gene,OsMPK14(GenBank Accession No.GQ265780)from rice(Oryza sativa L.),was cloned by RT-PCR.The full-length cDNA of OsMPK14 consists of 1660 bp in size,containing an open reading frame of 1629 bp,which encodes a 542-amino-acid polypeptide and has a typical protein kinase domain and a phosphorylation activation motif TDY.Sequence alignment and analysis reve...     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

桑树MaUBC-C基因的表达模式分析及原核表达

泛素结合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用,参与植物的生长发育、逆境胁迫、免疫响应等生理活动。本课题组前期通过分析桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding-associated virus, MVBaV）侵染的桑树品种‘桂桑优62号’（Morus atropurpurea）转录组获得了上调表达的基因MaUBC-C。为探究泛素结合酶MaUBC-C基因的功能,本研究以‘桂桑优62号’桑树为材料,克隆MaUBC-C的CDS序列进行生物信息学和表达模式分析,并对其进行原核表达获得该蛋白。结果显示,MaUBC-C编码区全长为567 bp,编码蛋白含188个氨基酸,大小为21.03 kDa,属于亲水、酸性、不稳定的核定位蛋白,具有保守的UBC结构域。将其氨基酸序列与其他物种的UBC氨基酸序列进行比对和进化分析,发现MaUBC-C与川桑MnUBC-C的相似性最高为98.40%,且具有最近的进化亲缘关系。荧光定量PCR分析MaUBC-C基因表达模式,结果显示MaUBC-C在桑苗的根、茎、叶中均有表达,其中在根部表达量最高,分别是茎和叶的1.24倍和1.71倍;对外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物胁迫（低温、高温、高盐、干旱）处理均产生响应,且在ABA和MeJA处理下表现出显著上调,在24 h时的表达量分别为正常水平的29.55、9.05倍,推测MaUBC-C在桑树的生长发育中具有广泛的调控作用,参与桑树的激素信号转导和对非生物胁迫的防御反应。利用无缝克隆技术构建MaUBC-C原核表达载体pET-30a-MaUBC-C并转化大肠杆菌BL21,0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下进行诱导,获得约为25 kDa的融合蛋白,与预期大小相符,为今后进行MaUBC-C基因功能研究提供了基础材料。本研究为进一步探究桑树泛素蛋白酶体途径的作用机制奠定了基础。     

一个水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP的克隆及表达分析

 通过荧光差异显示和RT PCR技术,克隆到一个新的水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP。序列分析表明,该基因cDNA序列全长2094 bp,编码一个具有569个氨基酸残基的多肽,推测分子量为63.2 kD;在OsCaMBP蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象,与其他植物中的钙调素结合蛋白的相似性介于38.25%~47.28%。在热激处理15 min、30 min、 1 h或2 h后,该基因在水稻的叶、根和叶鞘中表达量急剧增加;此外,该基因表达量也受低温调控而增加。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

抑制水稻隐花色素基因OsCRY1a表达对水稻农艺性状的影响

 利用已公布的OsCRY1a基因的序列设计引物,扩增部分基因片段,构建RNAi植物表达载体并转化水稻,导致该基因表达水平下降和功能缺失。根据转基因植株重要农艺性状的表现,分析该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY1a基因的表达,水稻开花期推迟16 d,株高和粒长明显增加,而其他重要农艺性状如剑叶长、宽和穗长等无明显变化。     

Cloning and Expression Analysis of OsNADPH1 Gene from Rice in Drought Stress Response

Drought resistance in rice has long been one of the important scientific research programs in cereal crops [1-3]. At present, the finding of novel drought genes is common in rice genetic resource development and varietal improvement. According to the action modes, the drought resistance genes can be divided into two classes [4]. The first class constitutes functional genes coding for such enzymes as late embryogenesis abundant protein (LEA) [5], △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) …     

花生AhFUSCA3基因的原核表达及在非生物胁迫下的表达分析

根据本实验室已获得的花生AhFUSCA3基因(NCBI登录号JX420284)序列,设计特异引物,构建原核表达载体,进行了重组蛋白表达分析,获得了分子量为42KD左右的目的蛋白条带;利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time RT-PCR)方法,检测了AhFUSCA3基因在低温、高盐和干旱胁迫条件下的表达情况。结果显示,AhFUSCA3基因在低温和高盐处理的花生叶片中表达量明显上调,但在干旱处理的叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhFUSCA3基因可能参与了花生对低温、高盐和干旱的抗性调控。