表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

鸡传染性支气管炎病毒S蛋白的研究进展

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性、病毒性传染病,主要侵害鸡的呼吸道、泌尿生殖道、消化道等系统。鸡传染性支气管炎病毒为冠状病毒科冠状病毒属的代表种,含有完整的27~32kb的单股正链RNA。病毒粒子略呈球形,直径约为80~120nm,有时呈多形性。IBV有三个主要结     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达

将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)SC株S1基因，连接到pMD 18-T载体上，克隆后进行了核酸序列分析，证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H120和M41的同源性较低，分别为81．1％和80．0％，而与国内JX9901株的同源性达到91．3％，初步证实国内存在IBV新毒株。     

鸡传染性支气管炎北京地方株S1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应技术从北京地区３株鸡性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎＩ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ１,ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ２和ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ３。     

重组杆状病毒表达的2株传染性支气管炎病毒S1蛋白的免疫原性评价

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了2株重组杆状病毒rAcJS9503S1和rAcSD9701S1，分别表达了2株致病性不同的传染性支气管炎病毒的S1基因。用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液对2周龄的伊莎公雏进行免疫，根据鸡免疫后的抗体水平动态变化和攻毒后鸡肾脏和气管的保护力判定它们的免疫原性。结果显示，重组杆状病毒表达的IBVS1蛋白可以诱导抗体产生和免疫保护反应，2毒株间也存在着一定程度的交叉免疫保护反应。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础.     

传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的克隆与原核表达

根据GenBank中IBV基因序列,设计合成一对引物,成功地从IBV H52基因组中扩增了S1基因。经测序证实该序列全长1 685 bp,编码538个氨基酸。为便于表达,对其进行弃信号肽克隆,然后定向连接到表达载体中获得重组表达质粒pGEX-S1,转入受体菌,经诱导成功的表达了重组蛋白GST-S1。SDS-PAGE显示,该蛋白约为80 kD,占菌体总蛋白的8%,West-blot表明,其具有良好的免疫学活性。IBV S1基因的克隆和表达,为研究病原与细胞相互作用、开发基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株（SY株）的免疫原S1基因cDNA，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点中，测定插入片段核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。序列分析表明，SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、N1-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80%。     

鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达及其免疫原性

为了对鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)广西优势血清型代表株GX-YL5的S蛋白进行真核表达并研究其免疫原性,设计GX-YL5毒株S基因特异引物,扩增出目的片段后,构建重组表达载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S,转化DH10Bac细胞获得重组杆...     

鸡传染性支气管炎病毒BD01株S1基因的特性分析

用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DB01株S1基因,获得了约1.7 kb的基因序列,利用DNAMan软件对DB01株S1基因的核苷酸和氨基酸序列与标准疫苗株H120、H52和M41进行比较.结果表明,其同源性均低于80%,亲缘关系比较远.在DB01的S1蛋白氨基酸序列上出现了5个新的糖基化位点,1个糖基化位点丢失,其中有3个变异位点在抗原表位上.亲水性也发生了较大变化.     

传染性支气管炎病毒S1蛋白在Vero细胞的表达与分布

将传染性支气管炎病毒（IBV）ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP—C2中，成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞，借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色（ICC）结果显示，抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞，表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明，S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内，而胞核中未见分布，提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。     

传染性支气管炎病毒S1基因遗传变异研究

本文利用计算机互联网分析了传染性支气管炎病毒（IBV）Buead株（呼吸型）和Z株（肾病型）S1基因的遗传变异规律。经与Genbank中50余个传染性支气管炎病毒的S1基因序列比较研究表明：Beaud株和Z株均存在着高度变异和相对保守区，两株病毒S1基因含有5－6个插入变异区。本文同时分析了两株病毒S1蛋白氨基酸序列的变异规律，研究表明：各株传染性支气管病毒之间S1蛋白的氨基酸序列有局部变异，其中105－106个氨基酸保持恒定不变。功能位点分析表明：Z株与Buead株抗原位点的位置和组成已发生变异，糖基化位点除Z株出现两个新位点外，其位置没有发生变化，但其组成已发生较多变异。