黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)辽宁分离物繁殖在葫芦(Lagenaria siceraria)上,用葫芦作为繁殖寄主进行病毒提纯,将提纯病毒制剂免疫家兔制备多克隆抗体,抗体效价为1∶320000,建立了间接ELISA检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测病汁液的灵敏度为1∶32000,检测提纯病毒的灵敏度为4.75×10-5mg。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒是葫芦科上的重要病毒之一，给葫芦科作物的生产造成严重威胁。目前，国内学者对该病毒研究不多，但该病毒因其潜在的经济影响，在国外已受到高度重视，并且在进口的种子中已有截获，为促进对该病毒进行更深入的研究，对其病原生物学、分子生物学及检测防治方面的研究结果进行了综述。     

利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测

【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。     

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生和防治

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是2012年江苏新发生在葫芦科作物上的一种病毒病害,主要发生在大棚西瓜上,病源随西瓜种子或种苗调运进入江苏,目前在苏南、苏中、苏北等地均有发现.本文叙述了CGMMV的特点、分布、传播途径和危害规律,确定绿脉、斑驳为其特征性症状的简易识别方法和5月份前在大棚西瓜发生的花叶病毒病多数为CGMMV危害的辅助识别手段,提出目前江苏该病毒防治应在加强宣传培训的基础上采用“检、消、扑、治”的防治策略.     

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定

为确定从江苏省洪泽县大棚西瓜、仪征市露地瓠瓜、东台市露地南瓜上采集到3个表现为褪绿、斑驳花叶症状的病样是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)侵染,采用电子镜观察、RT-PCR和序列测定方法对其进行鉴定。电子显微镜下可见300 nm×18 nm大小的直杆状病毒粒子。根据已报道的CGMMV外壳蛋白质(cp)基因序列合成特异性引物,对所提取病样的总RNA进行RT-PCR扩增,3个分离物的RNA模板中均可扩增到大小为500 bp左右的DNA片段,测序结果表明3个分离物的片段均含有486个核苷酸,包含完整的cp基因,编码161个氨基酸。3个分离物与已报道的7个CGMMV分离物核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为91.8%～99.8%和98.1%～100.0%,与同属的其他3个病毒(Kyuri绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒和小西葫芦绿斑驳花叶病毒)cp基因核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为40.7%～54.7%和44.4%～60.2%,表明所采集的3个病样由CGMMV侵染引起。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

上海郊区黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定和防治对策

在上海市浦东新区孙桥蔬菜基地温室内发现大量黄瓜植株发病,叶片出现花叶、斑驳、皱缩和变形等症状,发病率达50%以上。经DAS-ELISA、RT-PCR和摩擦接种试验鉴定,发现引起黄瓜发病的病原生物是黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus),并提出了防治对策。     

RT-PCR法特异性快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,建立该病毒的快速检测方法。该方法可以从带毒叶片中扩增到约591 bp的片段,而TMV属其他9种病毒均无特异性扩增。本方法也适用于带毒种子的检测,具有准确、灵敏及时效性强等特点,为进出境植物检疫和农业安全生产提供可靠的技术支持。     

黄瓜花叶病毒（CMV）高效价抗血清的制备及其在ELISA中的应用

以提纯的ＣＭＶ作为抗原，经静脉注射，肌肉注射和足垫注射等对家兔进行免疫，获得高效价的抗血清（琼脂双扩散效价为１／２５６），在间接ＥＬＩＳＡ试验过程中，用ＰＢＳ＋０．０５％，ＴｒｉｔｏｎＸ－１００作为样本研磨液，用１：１６０００稀释度的ＣＭＶ抗血清或２μｇ／ｍｌＣＭＶ抗血清的ＩｇＧ作为第一抗体，用１：１０００稀释度的冻干辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的ＩｇＧ作为第二抗体，以待测样本光密度值与阴性对照光密     

诱导提取的dsRNA粗提液对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抑制作用

在已测序的黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列的基础上,设计特异引物,扩增全长基因,将其插入到原核表达载体L4440的2个T7启动子之间,构建能诱导形成双链RNA (dsRNA)的原核表达载体L4440-MP,并转化大肠杆菌HT115(DE3),经IPTG诱导,提取了高质量的dsRNA.将提取的dsRNA对黄瓜进行抗病性...     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析及其分组

为了揭示黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)河北分离物分子变异及系统进化情况。本研究自河北省5个代表性西瓜产区采集病样,分离纯化获得5个CGMMV河北分离物,经RTPCR扩增、基因克隆获各分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列。使用Vector NTI 10.0软件(Informax,Frederick,MD,USA)和MEGA5.0软件(Koichiro,Tokyo,Japan)对河北省5个分离物及GenBank已登录其它分离物CP进行序列分析,构建系统发育树。系统进化关系分析表明:所有CGMMV分离物可划分为5个组,CGMMV河北分离物与中、日、韩三国分离物亲缘关系较近,位于同一组别。与希腊2个分离物(CGMMV-GR5、GR3)亲缘关系最远。CGMMV CP序列相似性分析结果表明:河北省5个分离物CP核苷酸、氨基酸序列相似性在99%~100%之间,与其它17个分离物序列相似性在92%~100%之间。与中国LN及Liaoning两个分离物及韩国Watermelon分离物相似性最高为100%,与希腊2个分离物(GR5、GR3)序列相似性最低为92%~99%。揭示了CGMMV河北分离物的分类地位及其与不同来源分离物之间的遗传进化关系,为进一步研究CGMMV株系划分、基因遗传变异提供了理论基础。     

引进种质西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

从日本引进的西瓜种子隔离种植后,采用生物学、双抗体夹心酶联方法及反转录PCR(RT-PCR)技术对其幼苗样品进行了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的检测,结果表明:生物学试验接种的黄瓜健康植株全部发病;双抗体夹心酶联试验结果均为阳性;RT-PCR反应后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果出现预期的715 bp特异性扩增产物。3种方法均表明此次从日本引进的西瓜种质已经受到黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染,须做销毁处理。试验结果表明,采用3种方法中的2种对样品进行检测,即可以根据检测结果确诊被检对象是否带有CGMMV病毒。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒提纯和抗血清制备

采用PEG沉淀并结合差速离心技术,获得了精提纯的侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV-Li).提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线.OD260 nm/OD280 nm=1.236.将提纯病毒免疫兔子制备得CMV-Li抗血清.经微量沉淀法和间接ELISA法测定,其效价分别为1∶1024、1∶4096.两种方法相比,间接ELISA具有灵敏度高、特异反应强等优点.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率

[目的]加强种子带毒检测,防止黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)通过种子传播而导致该病害的扩散和流行.[方法]以感染CGMMV的西瓜、甜瓜病株收获的种子为材料,应用DAS-ELISA检测感染CGMMV的种子带毒率和传毒率.[结果]250粒西瓜种子全部为阳性,带毒率达100%;623株西瓜幼苗14株为阳性,传毒率为2.25%.130粒甜瓜种子122粒为阳性,带毒率达93.85%;2 050株甜瓜幼苗58株为阳性,传毒率为2.83%.灵敏度检测种子带毒量在感染种子研磨样体积与健康种子研磨样体积为1/1 000时仍检测是阳性;叶片带毒量在病叶研磨样体积与健康叶研磨样体积为1/10 000时仍检测是阳性.[结论]感染CGMMV西瓜、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主.灵敏度检测表明DAS-ELISA能进行大批量的种子检测.     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为...     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

利用DAS-ELISA检测侵染观赏百合黄瓜花叶病毒的研究

从制备的黄瓜花叶病毒———观赏百合分离物(CMV-Li)抗血清中提纯了IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了检测CMV-Li的DAS-ELISA(double antibody sandwich-enzyme-linked immumnosor-bent assay)系统,利用此检测系统并结合生物学方法,对临洮切花百合田间病样和百合不同部位带毒量进行了检测,结果发现CMV-Li的侵染率为23.81%,叶片的带毒量明显高于花和鳞茎.