柱花草总RNA提取方法比较

以热研2号柱花草（Stylosanthes guianensis Reyan No.2）叶片为材料,利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较SDS 酚抽提法、CTAB法、Trizol试剂盒和柱式植物RNAout试剂盒法提取柱花草总RNA的质量和纯度。结果表明,改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA的OD260 nm/OD280 nm分别是1.85和1.93,OD260 nm/OD230 nm均大于2.0。凝胶电泳结果表明,改良CTAB法及柱式植物RNAout试剂盒法均有28S rRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解。其他两种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象。将改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA逆转录成cDNA,cDNA能扩增出一条清晰的β actin基因片段,进一步证明了改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的总RNA具有很高的纯度,其中柱式植物RNAout试剂盒法的效果好于改良CTAB法。     

禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为了能快速准确地对禽流感进行病原学诊断，根据流感病毒的M基因序列，在保守区内用Olig04．0软件设计了1对引物，建立了一步法RT—PCR诊断方法，其目的片段大小为229bp。通过对不同稀释倍数的H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行检测，结果显示，病毒尿囊液的最低检出稀释度为1：10^4；阳性棉拭子的最低检出稀释度为1：2^3。用病毒分离法和一步法RT—PCR同时检测人工感染鸡不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品，二者符合率为100％，但前者的检测灵敏度比后者高10～100倍。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原，所有禽流感病毒均有229bp的目的条带出现，而其他14种禽病病原均无目的条带出现，表明该方法的特异性好。     

五种核酸提取试剂盒对新城疫病毒RNA提取效率的比较

本研究采用罗氏、天隆、赛默飞世尔等公司生产的5种核酸提取试剂盒,对新城疫病毒RNA的提取效率进行比较,以优选出提取效率高、耗时短、成本低的核酸提取方法,为各级实验室开展新城疫病毒核酸检测提供技术参考。采用5种商品化核酸提取试剂盒,对不同浓度(稀释度10~0~10~(-8)/EID50 10~(8.3))的新城疫病毒标准样品进行RNA提取,通过实时定量荧光RT-PCR进行检测,以Ct值评价5种试剂盒的RNA提取效率,并对试剂盒的RNA提取时间和价格等进行综合比较分析。结果显示:High Pure Viral RNA Kit(罗氏)、动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒(天隆)和Lab Serv Viral Total NA Kit(赛默飞世尔)的RNA提取效率较高。其中,Lab Serv Viral Total NA Kit对低浓度样本的RNA提取效率最高,价格最便宜;Tian Long的RNA提取所需时间也较短,但操作最为简便。综合提取效率、时间及成本等因素,分析认为Lab Serv Viral Total NA Kit(赛默飞世尔)性价比最高,适用于大批量临床样品的集中检测。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT—PCR技术扩增口蹄疫病毒（FMDV）编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因，经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）中，重组质粒pcDNA3．1（＋）-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞。用纯化的目的蛋白进行Western—blotting鉴定，并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示，获得分子质量约55ku的单一3D基因表达产物，其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术，证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。     

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限(LOD)、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(A、B、C)的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示：3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数(R²)分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10^-1～10^-2 copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长(105 min),LOD为10^-2 copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异(P> 0.1),批内变异系数(CV)在1.5%以内。结果表明：3种荧光PCR检测试剂盒的综...     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

猪瘟病毒一步法RTPCR检测方法的建立

 本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA,经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法,RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份,阳性检出率为92.3%;结果表明,建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

5种商品化试剂提取病毒RNA的比较研究

选择商品化的3种细胞裂解液(RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT)和2种DNA/RNA共提试剂盒(RNA-DNA双提试剂盒、快速DNA/RNA共提试剂盒),分别提取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株、猪瘟病毒(CSFV)HCLV株和乙型脑炎病毒(JEV)SA-14-14-2株的RNA,通过RNA直接定量和Real-time PCR间接评价了抽提的RNA的质量。RNA直接检测结果表明,RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT 3种细胞裂解液抽提获得的RNA浓度相对较高;Real-time PCR间接检测结果表明,快速DNA/RNA共提试剂盒组RNA相对水平最高,RNAiso Plus和TRNzol Plus 2种细胞裂解液组其次。研究表明,RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT 3种试剂可用于临床RNA病毒检测以及定量分析。     

2种微生物药剂防治草原蝗虫的应用研究

为考察不同剂型金龟子绿僵菌对青海地区草原蝗虫的防治效果,开展绿僵菌油悬浮剂和绿僵菌可湿性粉剂对草原蝗虫的防治试验。绿僵菌油悬浮剂和绿僵菌可湿性粉剂各设置3个试验小区,分别为A1、A2、A3区和B1、B2、B3区,A1和B1区为平地,A2和B2区为上坡地,A3和B3区为下坡地,同时设CK对照区;于施药前及施药后第5、10、15、30天对各试验区进行草原蝗虫虫口密度调查,计算施药后第5、10、15、30天的虫口减退率,采用统计学方法对各试验区的草原蝗虫防治效果进行比较。结果表明：施药前各试验处理区的虫口密度与CK对照区差异均不显著（P〉0.05）,绿僵菌2种剂型施药后第5、10、15、30天,各处理区的虫口密度均显著低于CK对照区（P〈0.05）;施药后第10天,A2、A3区的虫口减退率显著高于B1、B2、B3区（P〈0.05）;施药后第15天,A1、A2、A3区的虫口减退率显著高于B1、B2、B3区（P〈0.05）;施药后第30天,6个处理区的虫口减退率均高于65%,绿僵菌油悬浮剂在下坡地施药效果最佳,虫口减退率达到71.86%。总体来看,绿僵菌油悬浮剂的防治效果略优于绿僵菌可湿性粉剂,且施药于下坡地时防治效果更佳。金龟子绿僵菌2种剂型都具有一定的水平扩散能力,施药当年控制草原蝗虫持续效果较显著。     

牛轮状病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛轮状病毒（BRV）的普通PCR、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）三种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行检测,比较三种核酸检测方法的检出结果。三种核酸检测方法中LAMP最敏感敏感,能检测到1拷贝/μL,Real-time PCR能检测到100拷贝/μL,普通PCR只能检测到1×104拷贝/μL。但结合临床样品检测表明：常规PCR方法敏感度低会造成一部分漏检,LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较三种方法后,推荐用LAMP结合real-time PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛轮状病毒的检出率。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

两种柞蚕微孢子虫病病原致病力的比较

近年柞蚕微孢子虫病的发生有了新的变化,病原种类中寄生率较低的Nosemasp.(一种未命名的小孢子)发生比例在逐年上升。比较原来的寄生优势种柞蚕微粒子虫与Nosemasp.对蚕的致病力,结果表明:Nosemasp.的致病力与柞蚕微粒子虫相当。发生比例上升的原因多数是镜检遗漏所致。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

中蜂多层小蜂箱与意蜂标准箱生产性能比较

中华蜜蜂是我国饲养的重要蜂种之一。相较于西方蜜蜂较为统一的朗氏标准蜂箱,中蜂的蜂箱种类繁多。研发了1种中蜂多层小蜂箱,并对其生产性能进行了测定与比较。结果表明,中蜂多层小蜂箱蜂蜜夏季采集量略高于意蜂标准箱组,但差异不显著。多层小蜂箱蜂蜜波美度和含糖量高于意蜂标准箱组,含水量低于意蜂标准箱组,但差异也不显著。多层小蜂箱中蜂群势显著高于意蜂标准箱饲养组,表明多层小蜂箱比传统蜂箱更利于蜜蜂生产与繁殖。     

一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道

自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）特异性引物进行RT-PCR 扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。