奶牛瘤胃微生物DNA提取法的研究与优化

试验通过对提取瘤胃微生物DNA常用的方法进行比较,优化出一种可以获得完整瘤胃微生物总DNA片段的方法,使其能进一步满足PCR的扩增要求以及后续的分子生物学研究。试验的瘤胃液样本取自3只装有瘘管的荷斯坦奶牛,将方法适当改进。结果表明:珠磨-CTAB法提取的总DNA片段长度大于20 kb,OD260/OD280在1.8以上,DNA的提取效果最稳定。同时对所提的DNA样本应用PCR方法进行了检测,成功扩增出长度分别为1 500 bp、1 000 bp左右的瘤胃细菌和古细菌的16S rDNA序列。结果证明了该方法所提取的瘤胃微生物DNA可以应用到后续的试验研究工作中。     

反刍动物瘤胃微生物培养组学研究进展

瘤胃微生物被称为反刍动物的“隐藏器官”,与宿主营养物质的获取和生理健康的维持密切相关;目前宏基因组测序发现瘤胃中超过5 800个基因组,然而超过90%的微生物尚未被培养,处于“生物信息黑箱”^[1]中。培养组学是一种采用多种培养条件,结合高通量测序技术鉴定菌种的培养方法。高通量、并行化的培养组学技术在瘤胃微生物中的应用,为在菌株水平上研究重点菌株功能及其与宿主互作关系提供了新的视角。然而,目前培养组学运用于瘤胃微生物的研究仍然较少,尚处于起步阶段。本文从瘤胃微生物特点、培养组学技术及其在瘤胃微生物培养中的应用现状、面临挑战等方面进行综述,为不断优化、规范化培养组学研究方案、拓展瘤胃可培养菌株资源、加快瘤胃生物信息黑箱的破解提供思考。     

东北梅花鹿瘤胃微生物基因组的DNA提取

为了优化东北梅花鹿瘤胃微生物DNA的提取方法,试验将鹿麻醉后采用穿刺法采集瘤胃液,采用物理、化学相结合的方法提取瘤胃微生物DNA,筛选东北梅花鹿瘤胃微生物DNA提取的理想方法。结果表明:提取东北梅花鹿瘤胃微生物基因组DNA的最理想方法是粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)的反复冻融法。     

鹌鹑肠道微生物总DNA的最佳提取方法

为了获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA,试验采用常规的饱和苯酚/氯仿法(方法一)、牛瘤胃DNA的提取法(方法二)和对上述两种方法进行优化后得到的肠道微生物DNA的提取法(方法三)对鹌鹑肠道微生物总DNA进行了提取,并对结果进行了比较。结果表明:应用方法一和方法二提取的DNA浓度比较低,电泳显示样品DNA条带没有方法三明亮;以方法三提取的肠道总DNA为模板,采用细菌通用引物,对其16S rDNA V3可变区进行PCR扩增,得到较清晰的图谱,条带整齐。说明采用方法三提取鹌鹑肠道微生物DNA较完整,可用于后续的分子生物学试验研究。     

一种禽类血液基因组DNA高效提取通用方法的建立

为了建立一种适合禽类血液的廉价、高效、通用的基因组DNA提取方法,试验采用鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、麻雀6种禽类血液为材料,提取的禽类血液DNA经微量分光光度计分析、基因组DNA凝胶成像分析以及PCR扩增效果检测。结果表明:提取的6种禽类血液DNA质量较好(OD260/OD280值范围为1.80~1.84,OD260/OD230值范围为2.21~2.30),基因组DNA电泳主条带和PCR扩增产物条带清晰、整齐、无拖带。说明本方法能够完全适用于大批量禽类血液基因组DNA的提取,且DNA纯度较好,满足后续相关分子生物学试验要求。     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

微生物总DNA的提取

目前,对微生物多样性的研究越来越多地从传统的培养方法转向分子生物学方法,现代分子生物学技术的蓬勃发展解决了不可培养微生物研究的难题,使肠道微生物的研究进入了一个新的发展阶段,而肠道微生物总DNA的提取是整个分子生物学方法的关键.主要总结了前人提取土壤、植物、粪便、瘤胃和肠道微生物DNA的试验方法,介绍了微生物总DNA的纯化方法,为用于分子生物学研究的肠道微生物总DNA的提取提供依据.     

从猪血中提取高质量基因组DNA的研究

经研究改进 ,建立了一种从猪血中提取高纯度全基因组DNA的有效方法。经 2 %琼脂糖凝胶电泳检测 ,DNA带型整齐集中 ,无拖尾现象 ,证明DNA分子片段完整 ,没有降解。紫外分光光度计检测 ,DNA的OD2 60 /OD2 80 达 1.75± 0 .0 5 ,证明所提DNA质量较好 ,用于PCR扩增 ,可以得到满意的扩增效果 ,且避免了用苯酚等剧毒试剂 ,是一种理想的DNA提取法     

细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术

试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。     

瘤胃微生物总DNA快速提取法研究

本文介绍了一种简便快速地提取瘤胃微生物细胞总DNA的方法,该法是对提取植物的CTAB法进行改进而成。与经典反复冻融 SDS/蛋白酶K裂解法相比,该法可在数小时内高效地提取瘤胃内容物总DNA,经琼脂糖凝胶电泳对所提取瘤胃微生物总DNA进行检测,证明所获得的瘤胃总DNA符合分子生物学操作要求。     

瘤胃微生物总DNA快速提取法研究

本文介绍了一种简便快速地提取瘤胃微生物细胞总DNA的方法,该法是对提取植物的CTAB法进行改进而成.与经典反复冻融＋SDS/蛋白酶K裂解法相比,该法可在数小时内高效地提取瘤胃内容物总DNA,经琼脂糖凝胶电泳对所提取瘤胃微生物总DNA进行检测,证明所获得的瘤胃总DNA符合分子生物学操作要求.     

宏基因组学用于瘤胃微生物代谢的研究进展

瘤胃微生物生态群落是一个非常复杂的生物体系,有着巨大的基因资源以及丰富的生态资源.宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在研究瘤胃微生物代谢和开发瘤胃微生物资源上展示出强劲的优势.该技术的应用有望解决反刍动物营养研究中诸多热点或难点问题.为此,本文介绍了宏基因组文库构建和筛选流程,详细讨论了流程中目的基因/基因组富集方法、载体选择原则和样品核酸提取等方法,并对瘤胃宏基因组学的应用现状进行了综述.     

实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

瘤胃微生物宏组学分析及研究进展

瘤胃微生物在反刍动物饲粮消化和吸收中起着重要的作用,深入探索瘤胃微生物群落结构、代谢活动和功能作用,对反刍动物健康和促进饲草利用效率具有重要意义。相对传统瘤胃微生物纯培养方法,组学技术能够更加全面对瘤胃微生物种类、代谢途径、功能进行解释,宏组学联用为系统理解瘤胃微生物降解纤维物质分子机理提供新方式,并受到研究人员越来越多的关注。本文总结了宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学与代谢组学在瘤胃微生物研究中的应用,并围绕宏组学技术联合应用进行综述,为反刍动物瘤胃微生物的研究提供理论支持。     

早食李基因组DNA的提取方法改进与试验

以改进的CTAB法对三华李品种群中的早食李叶片基因组DNA的提取进行了试验。结果表明,改进的CTAB法适于高质量三华李品种群基因组DNA的提取。提取的早食李基因组DNA完整性较好,无降解,OD260/OD280的比值在1.9-2.0之间,多糖类杂质去除较为干净。经SRAP检验,条带清晰,多态性良好,说明改良CTAB法提取的基因组DNA质量较好,适于三华李高质量基因组DNA的提取。不同时期的不同成熟度的叶片都可以提取到基因组DNA,但以各期的嫩叶（梢）产量最高,效率最好。     

不同油脂对瘤胃微生物体外产气及其区系动态变化的影响

本试验利用3头瘤胃瘘管山羊提供瘤胃液,以淀粉、纤维素、酪蛋白为底物进行体外培养,研究花生油、菜油、玉米油和豆油等对瘤胃发酵产气及微生物活力状况的影响。结果表明:培养液36 h总产气量在20.61～39.67mL,除花生油组与对照组差异不显著外(P>0.05),其他油脂组都显著低于对照组(P<0.05);随着培养时间的延长各组产气量呈现波动变化。培养液总脱氢酶以豆油组最高,显著高于对照组;并依次显著高于玉米油、花生油、菜籽油等组(P<0.05)。另外,培养液原虫DNA、细菌DNA、微生物DNA、原虫/细菌区系比例的均值与对照组,以及油脂组间差异都不显著(P>0.05),但随着培养时间的延长,微生物DNA在各时间点都以豆油与玉米油组的较高;原虫DNA一般在16 h达到最高,而细菌DNA则在8 h或16 h最高,并显著高于1 h或4 h的量(P<0.05、P<0.01),且各个试验组在培养过程中随时间的动态变化模式也不尽相同。总体看来,不同油脂对瘤胃微生物体外产气及区系动态变化的影响不同。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组DNA的提取及基因组survey分析

采用透析膜培养法结合DNA柱式提取法进行基因组DNA提取,同时利用第2代高通量测序技术,分析了捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组概况。结果显示:透析膜培养结合DNA柱式提取法所提取的基因组DNA质量及浓度均能达到测序标准;捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组约为37.6 Mb,GC含量为44.95%,基因组杂合度较低。结果表明:透析膜培养法结合柱式法提取其基因组DNA的方法简便可行,为丝状真菌DNA提取,提供了新的思路;基因组survey分析为捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因组精细图谱的绘制奠定了基础。     

瘤胃微生物与饲粮脂肪酸间的相互作用

脂肪酸是反刍动物重要的营养物质。一方面,脂肪酸对于反刍动物瘤胃微生物生长具有抑制作用,尤其是不饱和脂肪酸的抑制作用更明显;另一方面,瘤胃微生物群落能够通过生物氢化作用将不饱和脂肪酸氢化为饱和脂肪酸。本文针对饲粮脂肪酸与瘤胃微生物之间的相互作用进行了综述,涉及的研究方法包括体外培养法以及动物试验研究,结合分子生物学技术方法,为通过饲粮脂肪调控瘤胃微生物群落或结构提供新思路。     

六种试剂盒提取血液基因组DNA效果比较

为筛选一种高效、快捷的血液基因组DNA提取试剂盒,采集24份新鲜西藏绵羊血液样本,选用6种市售商业化试剂盒（LifeFeng柱式试剂盒DK601和非柱式试剂盒DK602,康为世纪非柱式试剂盒CW0544和柱式试剂盒CW0546,上海生工非柱式试剂盒SK8224和柱式试剂盒SK8254）,比较所提DNA的浓度、纯度、得率以及对嗜吞噬细胞无形体16S rRNA进行巢式PCR扩增,综合评价不同试剂盒DNA提取效果.结果表明,应用LifeFeng柱式试剂盒DK601提取的DNA浓度和纯度均最高,得率较高,分别达到75.63 ng/μL、1.894（OD260/OD280）、18.91 ng/μL;且嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因的PCR扩增条带清晰度最优.因此,LifeFeng DK601可作为提取绵羊血液基因组DNA及嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）病原鉴定的首选试剂盒.     

分子生物学技术在瘤胃细菌多样性研究中的应用

反刍动物的瘤胃是一个复杂的厌氧微生态发酵系统,研究其瘤胃微生物区系组成与功能已成为反刍动物营养学的重要内容,分子生物学技术是开展瘤胃微生物研究的重要技术手段。本文就变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S r DNA序列分析、宏基因组技术、DNA芯片技术等在瘤胃细菌多样性研究中的应用情况进行了总结与归纳,为今后开展此方面研究工作提供技术参考。