花青素调节基因VlmybA2对番茄遗传转化

以小型番茄Micro-Tom为材料,利用农杆菌介导法导入花青素调节基因VlmybA2.对抗性筛选出的再生植株进行GUS组织染色和PCR检测,证明外源基因已经整合到Micro-Tom中,转基因番茄根、茎、叶脉、果皮均呈紫色,花色为黄紫嵌合.而野生型的根为白色,茎、叶脉呈绿色,果皮为红色,花为黄色.对转基因番茄的花青素含量、叶片叶绿素含量和光合速率等生理指标进行测定,花青素含量有显著增加,叶绿素含量降低,VlmybA2基因过量表达会降低植株的光合效率,但对植株正常生长影响并不显著.VlmybA2基因既可增加抗衰老物质花青素含量,又可作为转基因植株的报告基因.     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

高羊茅FeTOC1基因的克隆、差异表达及亚细胞定位分析

拟南芥TOC1基因是中央振荡器的重要组成部分,其编码的蛋白质TOC1通过光周期途径调控拟南芥对光照的响应.为了揭示高羊茅FeTOC1基因的生物学功能,本研究通过同源克隆获得该基因全长cDNA序列,对其在不同光照水平下的表达模式进行分析,并对其编码的蛋白质进行亚细胞定位.结果显示,高羊茅FeTOC1基因的全长cDNA序列...     

反义乙烯受体LeFTR2基因对番茄的转化和功能分析

采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将LeETR2的部分反义序列导入番茄(Lycopersicon esculentum)子叶外植体，经抗性筛选和组织培养获得再生植株。通过对转基因植株中插入序列的PCR检测和Southern杂交，证明转化番茄成功。通过对LeETR2的功能的初步研究结果表明，转基因植株顶端优势丧失、极端矮化和番茄果实的内源乙烯合成量增加。这提示此基因在植物乙烯信号感受与转导系统中起着负调控的作用。     

鸡Perilipin1基因的克隆及亚细胞定位

本研究旨在克隆鸡(Gallus gallus)脂滴包被蛋白基因(Perilipin1)的cDNA序列,并检测其在鸡前脂肪细胞分化过程中的亚细胞定位.本研究以7周龄肉鸡腹部脂肪组织为材料,采用RT-PCR和RACE的方法扩增并克隆了鸡Perilipin1基因的5'UTR、CDS和3'UTR片段,分析了该基因的结构;以鸡原代前脂肪细胞为材料,利用免疫荧光及激光共聚焦技术,在诱导分化的不同时间点(12～120 h),检测了鸡Perilipin1在前脂肪细胞中的表达位置.结果表明,本研究获得的鸡Perilipin11基因5'UTR、CDS和YUTR序列总长度为2 379 bp,该基因由9个外最子、8个内含子组成(ATG位于第二外显子上);在鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中,Perilipin1始终包被在脂滴周围.综上,本研究成功克隆了鸡Perilipinl基因的完整cDNA序列并确定了Perilipin1在鸡前脂肪细胞分化过程中与脂滴的空间位置关系,该结果为深入开展鸡Perilipinl基因的功能研究,揭示鸡脂肪代谢的分子遗传机理提供了重要的理论依据.     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯产量的抑制

筛选番茄幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11，设计引物，利用RT-PCR方法从受到病原浸染的番茄叶片中获得长1018 bp的候选片段，同源性分析发现该片段与其他作物上已发表的ACO基因序列高度同源：同源率从83%~99%，推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上，用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉（RNAi）载体pD311，对番茄进行遗传转化，获得卡那霉素抗性植株27棵，分子检测证实外源片段成功导入其中番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明，RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达，从而导致乙烯的生成大大降低。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯释放的抑制

筛选番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11,设计引物,利用RT-PCR方法从受到病原侵染的番茄叶片中获得长1018bp的候选片段,同源性分析发现该片段与其它作物上发表的ACO基因序列高度同源,同源率83%～99%,推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上,用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉(RNAi)载体pD311,对番茄进行遗传转化,获得卡那霉素抗性植株27棵,分子检测证实外源片段成功导入番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明,RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达,从而导致乙烯的生成大大降低。     

影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析

将构建的携带NPTⅡ和AP-D基因的植物表达载体pBI121导入根癌农杆菌EH105中后,用其对草莓主栽品种丰香叶盘进行遗传转化,探讨了卡那霉素(Kan)的浓度、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和筛选方式等因素对转化率的影响。结果表明:丰香草莓适宜的转化条件是Kan筛选浓度为20 mg/L,预培养时间为2~3 d,菌液浓度OD6000.3~0.5,侵染时间10~20 min;共培养2~3 d后将外植体接到含有5 mg/L Kan和500 mg/L Carb的诱导培养基上进行培养,以后每次继代逐步提高Kan选择压力至终浓度20 mg/L(每次增加5 mg/L);或共培养2~3 d后将外植体接到含有500 mg/L Carb的诱导培养基上,培养2周后继代到含20 mg/L Kan和400 mg/L Carb的培养基上进行选择培养。根据PCR检测结果,抗性愈伤组织转化率高达18.5%。抗性愈伤组织经进一步诱导,最后获得了17株抗性植株。本文探讨了影响丰香草莓转化的多个因素,以期建立高效的遗传转化体系,为草莓属植物种质的遗传转化奠定基础。     

高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析

高羊茅在生长季出现生殖枝,抑制新枝形成,不利于草坪质量及其持久性生长。研究春化基因的分子特征,探索抑制生殖生长的分子育种新途径,对坪用型高羊茅品种改良具有重要意义。本研究在克隆高羊茅春化基因FaVRN1的基础上,构建高羊茅春化基因FaVRN1与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体p-FaVRN1-hGFP,利用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达,并运用实时荧光定量PCR分析春化基因FaVRN1在春化与非春化条件下的表达差异。研究结果表明,FaVRN1基因编码的蛋白产物位于细胞核,符合它作为转录因子特性;春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长逐渐增加。非春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长而降低。FaVRN1基因在春化条件下的表达水平远高于非春化条件,FaVRN1基因的表达受春化条件正调控。     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因OsITL1的克隆、亚细胞定位及表达分析

磷酸肌醇代谢在生物感受胞外刺激及信号转导中起着重要的作用.1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶（5/6-激酶）是磷酸肌醇代谢过程中很重要的一种酶,它具有肌醇激酶和蛋白激酶的双重功能.我们曾对拟南芥中的5/6-激酶基因AtITL1在逆境胁迫中的功能进行了研究,初步证明该基因与渗透胁迫有关（Chen et al.,2003）,本研究采用电子克隆的方法得到了水稻的5/6-激酶基因OsITL1,并对其亚细胞定位及在逆境胁迫下的表达特点进行了分析.     

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉（Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen）为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5＇非编码区、302bp的3＇非编码区...     

番茄LeNCED1基因5′-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。     

花生fw2.2基因的克隆及遗传转化

fw2.2基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究以番茄fw2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物对花生进行扩增,目标产物测序后,将推测的氨基酸序列与其他植物fw2.2基因编码的氨基酸序列进行比对,同源性为34.78%～66.8...     

水稻OSNADK3基因的克隆及其遗传转化

从韩国浦项科技大学（Pohang University of Science and Technology,POSTECH）水稻T-DNA插入突变体库PFG_3A-04871.R株系中筛选到一个NADK3（NAD Kinase 3）激酶（LOC_Os05g32210）基因OSNADK3表达缺失的突变杂合体。与其野生型D...     

OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响

利用已公布的水稻OsCRY2基因序列设计引物,扩增部分基因片段,成功构建了ihpRNA植物表达载体pSC1301-347-OsCRY2,并通过农杆菌介导法将OsCRY2干扰片段导入水稻获得了转基因植株。根据转基因植株主要农艺性状的表现,分析了该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY2基因表达会强烈延迟水稻开花与成熟;转基...     

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。     

苹果MxNas1基因正反义表达载体构建及转化烟草的研究

为研究笔者前期克隆的MxNas1基因功能,构建了苹果属植物小金海棠MxNas1基因正义和反义两种表达载体,并用农杆菌介导的叶盘转化法转化了烟草.对转基因烟草分别进行0和1μmol/L Fe处理14d后,转正义载体烟草在缺Fe情况下叶片没有黄化,表现出较强的抗缺Fe能力;转反义载体植株比对照烟草幼叶提前出现黄化现象,表现...     

生长调节剂PCPA和2,4-D对番茄果实果糖激酶活性及基因表达的影响

研究了花期施用PCPA和2,4-D对发育过程中番茄果实糖含量、蔗糖代谢相关酶和果糖激酶活性及果糖激酶基因表达的影响。结果表明,随着番茄果实的发育,果糖激酶的活性及其基因表达均先上升后下降,成熟时达到最低,但FRK1基因表达量较高;果糖和葡萄糖含量呈递增的趋势,成熟时含量达到最高。PCPA和2,4-D处理后降低了成熟番茄...     

植物防卫基因PvPGIP2和TaLTP4的克隆及其对小麦的转化

多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白和脂质转移酶蛋白是植物产生的防卫蛋白,对植物病原真菌具有防御作用。本研究利用同源基因克隆策略和RT-PCR技术,成功克隆了1个菜豆的多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白（PvPGIP2）编码基因和1个小麦的脂质转移蛋白（TaLTP4）编码基因;由于它们在功能上具有协同作用,我们以pAHC25为骨架构建了Pv...