电穿孔法用于大肠杆菌和苏云金杆菌的转化及质粒消除

利用电脉冲将质粒pHT3101和pHE－4D分别转入了大肠杆菌和苏云金杆菌,结果显示大肠杆菌DNA的转化率（转化子）为104～105·μg－1,苏云金杆菌的DNA的转化率（转化子）为102～103·μg－1．同时利用该法消除了Escherichiacoli菌株TG1和Bt菌株ISP78／11中的pHT3101质粒,消除率分别为88．6％和66．4％．比较了转化和质粒消除的条件并构建了一个工程菌．     

整合质粒对苏云金芽胞杆菌转化的研究

苏云金芽胞杆菌 (Ｂｔ)是一种革兰氏阳性菌 ,可产生具有杀虫活性的伴胞晶体蛋白 ,作为一种全球性生物农药广泛应用于农林害虫的防治。电脉冲法是细菌质粒转化中比较常用的一种方法 ,特别是在革兰氏阳性菌以及很多用常规方法不能转化的细胞 ,用电脉冲法可以成功转化[1] 。所以 ,电脉冲法目前已作为一种高效、简便和省时的方法 ,被用于Ｂｔ的遗传改良中。笔者所在实验室在构建Ｂｔ工程菌的过程中 ,发现按照常规的电转化方法 (用对数生长中期细胞制备感受态 ,ＯＤ660约为 2 0 0～ 2 2 0 ,电压为 6.2 5～9ｋＶ ｃｍ ,电阻为 2 0 0Ω ,电容为 2 5…     

整合质粒对苏云金芽胞杆菌转化的研究

苏云金芽胞杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性菌,可产生具有杀虫活性的伴胞晶体蛋白,作为一种全球性生物农药广泛应用于农林害虫的防治.电脉冲法是细菌质粒转化中比较常用的一种方法,特别是在革兰氏阳性菌以及很多用常规方法不能转化的细胞,用电脉冲法可以成功转化[1].所以,电脉冲法目前已作为一种高效、简便和省时的方法,被用于Bt的遗传改良中.     

苏云金芽孢杆菌原生质体的制备及大质粒转化

研究苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最佳条件,为进一步提高原生质体转化率打下基础。通过酶解法对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种工业生产菌株(Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki)2671原生质体的制备及再生条件进行了研究,考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间等影响因素,采用PEG法对大质粒进行原生质转化。结果表明,对数生长前期的菌体(培养3 h),以SMML作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度7 mg/m L,40℃下酶解40 min,原生质体生成量可达5.7×107个/m L,再生率可达14.1%。在此条件下,采用PEG法可将大质粒p LTV1-ep成功转化宿主菌,转化率为0.3 CFU/μg。     

一种改良的苏云金芽孢杆菌质粒DNA提取方法

以Sambrook的碱裂解法为基础,通过控制菌体培养时间,适当调整提取过程中3种溶液的比例及作用时间,摸索出一种适合于提取苏云金芽孢杆菌质粒DNA的方法.该法与常规碱裂解法相比具有重复性好、质粒DNA质量高等优点.     

黄芩和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究

目的：研究黄芩和黄连对大肠杆菌Ｒ质粒的消除作用。方法：以黄芩和黄连的提取物为质粒消除剂，携带Ｒ质粒的多重耐药性大肠杆菌Ｅ．１０２株为靶细胞，采用倍比稀释法和影印培养法及Ｋａｄｏ法，观察黄芩和黄连作用不同时间对大肠杆菌Ｒ质粒表达的影响。结果：黄芩和黄连作用２４ｈ，对大肠杆菌Ｒ质粒的消除率为５％￣２．４２％，延长时间至４８ｈ，消除率为２６．１４％￣２２．５７％。两个时间的消除率差异有显著意义（Ｐ〈０．     

苏云金芽孢杆菌质粒复制区的分离克隆

Bt-E.coli穿梭载体pHT315去除Bt复制区,构成了一个具有红霉素和氨苄抗性,同时具有多克隆位点的只能存E.coli中复制的载体,命名为pHT315-1。利用pHT315-1,通过部分酶切建库的方法,从近10 000个重组子中得到1个Bt复制区。序列测定结果表明,该复制区为5273bps,已在GentBank注册,Accession number为AY278324。GenBank核酸序列Blast表明,该复制区部分序列与Bt菌株HD263的复制区。ori43编码复制蛋白的宁列同源性为98％。30℃连续培养72h,复制区质粒在Bt无晶体突变株HD73cry-中稳定性达98％以上,30h生长曲线也表明,该复制区质粒对受体菌株无明显不良影响。     

中药连翘对大肠杆菌R质粒消除作用的研究

目的：探讨中药连翘对大肠杆菌R质粒的消除作用,使其重新恢复对抗生素的敏感性。方法：将大肠杆菌DH5α制备成感受态后,导入含有Ampr基因的质粒,再用连翘作用转化后的大肠杆菌,经培养12h后,挑出亚抑菌浓度的菌落涂于含有Amp的平板上培养24h,观察有无细菌生长,并通过电泳检测是否消除质粒。结果：在含有Amp平板上无大肠杆菌生长,在不含Amp的平板上细菌生长良好,质粒DNA电泳检测结果经中药作用过的大肠杆菌无质粒带,表明连翘对质粒具有消除作用。     

黄芩和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究

目的：研究黄芩和黄连对大肠杆菌Ｒ质粒的消除作用。方法：以黄芩和黄连的提取物为质粒消除剂,携带Ｒ质粒的多重耐药性大肠杆菌Ｅ．１０２株为靶细菌,采用倍比稀释法和影印培养法及Ｋａｄｏ法,观察黄芩和黄连作用不同时间对大肠杆菌Ｒ质粒表达的影响。结果：黄芩和黄连作用２４ｈ,对大肠杆菌Ｒ质粒的消除率为５％～２．４２％,延长时间至４８ｈ,消除率为２６．１４％～２２．５７％。两个时间的消除率差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。Ｒ质粒消除表型可以表现为单一或两种耐药性的丢失。结论：黄芩和黄连对大肠杆菌Ｒ质粒具有消除作用     

不同理化处理对苏云金芽胞杆菌质粒稳定性的影响

研究了用溴化乙锭诱变、升温和添加ＳＤＳ等３种处理对苏云金芽胞杆菌质粒稳定性的影响。结果表明,用４．５μｇ／ｍｌ的溴化乙锭处理野生菌株ＹＢＴ－１５２０和ＨＤ－５６７,对其携带ＩＣＰｓ基因的质粒的稳定性无影响。升温至４２℃时,野生菌株ＹＢＴ－１４６３和ＹＢＴ－９６０３的携带ＩＣＰｓ基因的质粒分别有０．４１％和０．３７％发生丢失,一些小质粒（〈２ｋｂ）也发生丢失。继续升温至４４℃和４６℃培养变株ＢＭＢ１     

大肠杆菌质粒与喹诺酮耐药性关系的研究

为研究大肠杆菌质粒与喹诺酮耐药性的关系，临床分离32株耐喹诺酮药物的致病性大肠杆菌，经质粒消除剂溴化乙淀（EB）、硫酸黄连素（BS）分别处理24h和48h，其中4株对喹诺酮的耐药水平明显降低。经消除剂作用的菌株提取质粒进行电泳检测， 结果只有大肠杆菌CE01[其中氧 氟沙星（OFL）的最小抑菌浓度（MIC）＞50μg/mL]的质粒带发生变化，且该质粒的转移与喹诺酮抗性有关。经消除剂BS作用24h，在含OFL 20μg/mL的琼脂不能生长的CE01XC1菌株其质粒带浓度显著降低；作用48h后，在含OFL 20μg/mL琼脂不能生长的CE01XC2菌株其质粒带被消除；BS作用48h后在含OFL 20μg/mL琼脂仍然生长的CE01XC3菌株及质粒带几乎未改变。另外3株耐药水平降低的菌株质粒带无变化。结果表明：大肠杆菌CE01含有与喹诺酮药物抗性有关的质粒，这一质粒被消除剂消除后，CE01菌株的耐药性显著下降，对OFL的MIC由大于50μg/mL变为小于20μg/mL。其它3株经质粒消除剂作用耐药水平降低的菌株可能是细胞膜通透性改变导致耐药。     

苏云金芽胞杆菌cryI基因探针的制备及质粒基因定位

将ｐＥＳＩ经ＥｃｏＲＩ酶解后回收纯化的含有苏云金芽胞杆菌ｃｒｙＩ基因高保守区的ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１的ＥｃｏＲＩ位点，通过ＤＩＧ体外标记转录制备高灵敏度、背景清楚的ＲＮＡ探针，并利用该探针进行苏云金芽胞杆菌８０１０杀虫基因定位．结果表明，该菌株编码杀虫晶体蛋白的基因位于相对分子质量３７×１０６的质粒上     

实时定量PCR测定苏云金芽胞杆菌质粒pBMB67的拷贝数

根据苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520的全基因组测序结果,在内生质粒p BMB67和染色体上分别选取单拷贝片段,利用实时荧光定量PCR法测得质粒p BMB67的拷贝数为21。此外,在内生质粒p BMB67的3个不同位点设计引物,分别以不同的靶片段作为实时荧光定量PCR的检测对象,测得p BMB67质粒的拷贝数分别为20.1、21.0和21.3,表明单拷贝靶片段的选择对测定质粒的拷贝数没有影响,进一步证明了实时荧光定量PCR测定质粒拷贝数的可行性。     

发根农杆菌Ri质粒转化康乃馨初步研究

利用具有Ri质粒的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Pri15834对康乃馨组培苗的带叶茎节进行转化试验。转化后的外植体在K0附加500mg/L羧苄青霉素培养基上培养2～3周后，受感染的伤口部位长出无向地性的毛状根，频率为37.07%。将毛状根切碎分别在K0、K1、K2培养基上继续培养3周，毛状根在K0上表现为无限生长，在K1上主要表现为长愈伤组织，频率为51.42%，而在K2上则主要表现为长绿苗，频率为25%。这说明发根农杆菌的Ri质粒已整合到康乃馨细胞基因组中并得到表达。     

三种质粒DNA对不同大肠杆菌菌株转化率的比较

将重组ＤＮＡ导入细菌细胞是分子克隆的中心工作之一．转化率的高低直接关系到实验成败．使用３种质粒ｐＢＲ３２２、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和ｐＵＣ１８，对３种大肠杆菌菌株进行转化，比较转化率，推荐使用１００ｍｍｌ／ＬＣａＣｌ２，ｐＨ６～８和４℃１２ｈ作为转化的优选条件。     

苏云金杆菌和培养基氨基酸的比较分析

通过分析伴孢晶体，芽孢，培养基及发酵液等的氨基酸比例，初步得到一些有关氨基酸参与代谢的资料，在发酵过程中，氨基酸既有累积又有消耗，特别是谷氨酸明显的被消耗，不同原料的氨基酸比例相差很大，这很可能是培养基影响杀虫毒力的主要原因之一。同一出发菌株８０１０分离得到的３号，５号和７２号菌株氨基酸比例稍不同，它们与有关资料报道的其它菌株的氨基酸比例有较大不同。伴孢晶体和芽孢之间的氨基酸比例胆显不同。Ｂｔ８０     

苏云金杆菌和培养基氨基酸的比较分析

通过分析伴孢晶体、芽孢、培养基及发酵液等的氨基酸比例，初步得到一些有关氨基酸参与代谢的资料．在发酵过程中，氨基酸既有累积又有消耗，特别是谷氨酸明显地被消耗；不同原料的氨基酸比例相差很大．这很可能是培养基影响杀虫毒力的主要原因之一．同一出发菌株８０１０（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒｋｕｒｓｔａｋｉ８０１０，简称８０１０）分离得到的３号、５号和７２号菌株氨基酸比例稍有不同，它们与有关资料报道的其它菌株的氨基酸比例有较大不同．伴抱晶体和芽孢之间的氨基酸比例明显不同．Ｂｔ８０１０菌种发酵需要供给较多的谷氨酸．     

将重组质粒高效导入农杆菌的电脉冲转化研究

利用电脉冲法将重组质粒PBI121/α-PAP导入农杆菌LBA4404,获得3.5×106转化子/μ g质粒DNA的转化效率.探讨了不同电激条件及农杆菌细胞生长状态对转化率的影响.结果表明,农杆菌LBA4404电脉冲转化的最适电激条件为电场强度18kv/cm,电容25μF,电阻200Ω;农杆菌最适细胞生长状态为OD600＝0.4～0.5.在一定范围DNA浓度与转化率成正比关系.     

河南省鸡致病性大肠杆菌耐药性质粒的研究

对河南省32个县市的93株鸡致病性大肠杆菌进行耐药性质粒的分析,并对其中12株100%耐庆大霉素(GM)的菌株进行耐药质粒的转化试验,成功获取了2个转化子。质粒检测结果表明:93株鸡致病性大肠杆菌可以分为49种质粒图谱类型,质粒电泳条带最多6条,最少1条,其中质粒图谱为1条条带的菌株占测试菌株的45.16%;同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似,不同地区菌株的质粒图谱不同,但它们之间会有相同或相近的少量流行质粒存在。质粒转化结果表明:同一质粒可编码1个至数个抗药性基因,不同质粒可以携带相同或不同的抗性基因,证明了质粒可以传递多种耐药性,细菌的抗药性与抗药性质粒的转移有很大关系。     

苏云金杆菌的发展和应用

简述了苏云金杆菌的杀虫作用机理及其应用现状,指出其存在的问题,并提出了解决的可能途径。