大肠杆菌不耐热肠毒素突变体作为佐剂的研究进展

黏膜免疫是防止病原菌侵入黏膜表面引起疾病的最有效的途径,通过黏膜免疫不仅能产生全身免疫反应,还能产生局部的黏膜免疫反应,该免疫途径无痛苦且易操作,同时减少疾病传播的风险.但大多数抗原的黏膜免疫原性都很差,通过口服或滴鼻免疫可溶性蛋白通常引起特异性免疫耐受,这些使得在黏膜免疫中使用恰当的佐剂成为必须. 不耐热肠毒素（Heat— labile enterotoxin,LT）是由肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia col i,ETEC）分泌的一种外毒素,既有较强的免疫原性又有较强的黏膜佐剂效应.但由于强的毒性,限制了它的广泛应用,因此通过构建各种突变体使之具备优良的佐剂活性且没有显著的毒性是当前研究的主要目标.本文主要从突变体的酶活性、毒性以及佐剂活性进行综述,为黏膜疫苗的研制打下一定基础.     

大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素快速检测方法的建立与应用

为了建立新型、快速的大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)的检测方法,试验采用LT-Ⅱ家族的保守序列设计交叉引物等温扩增技术(cross priming amplification,CPA)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,分别对这两种方法的反应温度、Bst聚合酶浓度和扩增时间进行优化,进一步对反应的特异性和敏感性进行研究,最后用这两种方法检测156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本,并以实时荧光定量PCR方法作为参照进行对比。结果表明:建立的LAMP和CPA方法对LT-Ⅱ基因具有很好的特异性,LAMP和CPA方法的最低检出限分别为6. 7×102cfu/m L和6. 7×101cfu/m L,CPA法具有更高的敏感性。对156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本的检出率为7. 7%(12/156),CPA、LAMP和实时荧光定量PCR三种检测方法的一致性为100%。说明建立的CPA方法不仅具有较高的特异性和敏感性,且不需要昂贵的仪器即能在短时间内完成靶基因的检测。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基表达系统的研究进展

正随着分子生物学的快速发展,各种工程菌株的遗传操作体系逐渐完善,蛋白质、酶和多肽制剂等产品的生产制备在满足科研需要的同时,也为生物制剂市场带来了巨大的经济效益~([1])。原核和真核表达系统是使用最广泛和研究最成熟的表达系统,利用原核或真核表达系统获取各种发酵产物开始进入工业化生产阶段~([2])。     

大肠杆菌不耐热肠毒素培养方法的研究

用兔肠结扎法、蓝斑法和琼脂扩散试验测定静置浅层、静置深层、振荡浅层和振荡深层培养获得的大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的滴度,证明静置浅层培养所获得的滴度比后三者高1～7倍,静置法比振荡法在生产上更容易推广。     

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体免疫佐剂活性研究

黏膜是病原体人侵的主要门户,黏膜表面有高度集中的淋巴组织,一个黏膜部位的免疫反应可以诱发所有黏膜效应组织免疫反应的出现。黏膜免疫还可以诱导全身免疫应答,是目前疫苗研究的新方向。但多数通过黏膜途径免疫的可溶性蛋白免疫原性都很弱,而且通过口服或滴鼻免疫还可能引起特异性免疫耐受,因此黏膜免疫中使用合适的佐剂以提高免疫原性和降低免疫耐受成为主要手段。大肠杆菌热敏性肠毒素（LT）是目前比较有发展前景的佐剂之一。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒PLTR72和PLT分别转化大肠杆菌JM101，DH5α和C600，并接种于LB和CAYE-2中培养，用GM1-ELISA法检测菌体裂解液中2者的表达情况，将表达产物纯化后用SDS-PAGE等方法鉴定。结果表明，3种大肠杆菌在2种培养基中都可表达出LT突变体和LT，并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中，成为具有GM1结合活性的突变体蛋白，鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型LT相同。均是1A：5B。     

猪大肠杆菌不耐热肠毒素基因的PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)保守序列为靶序列,设计合成了一对可扩增336 bp目的片段的引物,建立了检测ETEC不耐热肠毒素(LT)基因的PCR方法.该方法对987p 、鼠伤寒沙门氏杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和链球菌的检测结果均为阴性.对15株分离自腹泻仔猪的待检菌株进行检测,有3株LT基因阳性.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.     

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33．0Ku和13．0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13．0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素（cT）抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,TJTG192蛋白毒性相对较大。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的分子生物学及粘膜免疫佐剂效应

大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-Labile,LT)是由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)分泌的一种外毒素。LT既有较强的免疫原性又有较强的粘膜佐剂效应,其毒力较霍乱毒素(choleratoxin,CT)小而被认为是替代CT的最有潜力的粘膜免疫佐剂。本文从LT的分子结构、分子生物学特性、免疫原性、粘膜佐剂效应及其作用机制以及LT的粘膜免疫佐剂的应用等方面进行了讨论。     

大肠杆菌耐热肠毒素的结构与特性

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxic Escherichia coli,ETEC)是引起人和动物急性腹泻的常见病原菌,其危害在发展中国家尤其突出.引起腹泻的根本因素是ETEC分泌的耐热肠毒素(Heat-stable enterotoxin,ST)及不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT).现已清楚,ST单独或联合LT即可引起重症腹泻[1].LT是一种分子质量较大的蛋白质,在人源菌株与猪源菌株高度同源,免疫原性好,已研究得比较深入.ST为小分子肽,免疫原性很弱或缺少,对其研究颇受重视.     

大肠埃希菌不耐热肠毒素研究进展

大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)是产毒性大肠埃希菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素,由六聚体蛋白形成AB5型结构.A亚基具有ADP核糖基转移酶活性,而B亚基为五聚体,主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合.LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性.为了将其毒性与佐剂活性分开,研究者构建了一系列无毒或减毒的突变体.证明突变体具有佐剂活性,并发现没有毒性的AB复合物以及酶活性在佐剂活性中发挥的作用是分开的.野生型LT、LT突变体以及B亚基与外源抗原共同免疫机体后,对机体免疫系统具有调节作用.     

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的原核表达及其活性研究

为使大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,本实验通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,制备了突变体LTR72/G192的基因片段,经酶切和测序结果表明构建的表达载体pLTR72/G192阅读框架正确,而且相应位点氨基酸获得了替换。IPTG诱导表达目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测,表达出突变体重组蛋白为约30 ku和10 ku的两个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量相吻合。Western blot检测结果表明两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应。目的蛋白经纯化后进行ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,突变重组蛋白与野生型LT相比其酶活性和毒性均明显降低。纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡,ELISA结果显示,突变体LTR72/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高滴度的抗新城疫病毒的IgG和IgA。     

抗大肠杆菌耐热肠毒素中药方剂的筛选

肠毒素是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)在体内或体外生长时产生并分泌到胞外的一种蛋白质性毒素,按其对热的耐受性还可分为热敏感肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST) .大肠杆菌耐热肠毒素(ST)由分子量不足5 000的多肽组成,无免疫原性.     

大肠杆菌不耐热肠毒素LTB大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的构建及表达

为了获取大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,试验以产肠毒素大肠杆菌的大质粒为模板,采用PCR技术扩增大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,并将PCR产物克隆至p MD18-T载体中构建克隆质粒p MD18T-LTB;通过酶切、纯化将LTB基因与大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体p W425et连接构建成重组质粒p W425et-LTB,将p W425et-LTB转化至thy A基因缺陷型大肠杆菌X13感受态细胞中,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明:重组大肠杆菌表达出LTB蛋白,且表达的融合蛋白能被LTB特异性抗体识别。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在原核细胞中的高效表达

从含有LT全毒素基因操纵子的质粒EWD299中扩增出LT的B亚单位基因后定向克隆于原核表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，用IPTG诱导表达后，将全茵裂解，用SDS—PAGE和Western blot检测重组茵中外源蛋白的表达情况。结果表明，在原核细胞中高效表达了LTB蛋白，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的38％。     

大肠杆菌耐热性肠毒素的研究进展

随着分子生物学的发展 ,近年来 ,对大肠杆菌耐热性肠毒素的研究已从细胞水平 ,分子水平进入基因水平 ,在其分子结构与功能、理化特性、提纯方法与鉴定、致病机理、分子生物学等方面进行了大量的研究 ,本文就大肠杆菌耐热性肠毒素的研究概况作一简要的介绍。     

用PCR检测鸡大肠杆菌耐热肠毒素基因

用１对合成的特异性核苷酸片段,通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）,以鸡致病性大肠菌２０个血清型菌株提取的染色体进行扩增,标准阳性对照（ｐＳＬＭ－４００）及扩增到１６个大小的为１５０ｂｐ的ＤＮＡ阳性片段,其它自株及阳性对照株ｐＥＷＤ２９９未扩增到产物,斑点杂交表明,所扩增的阳性条带与标准耐热肠毒素基因（ＳＴ）杂交后呈强阳性。     

猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因的分子克隆

以ＰＣＲ方法克隆得到猪源大肠杆菌ＳＴ１基因缺失ＣｏｏＨ端了后两个编码密友和终止密码的ＤＮＡ片段,并以该片段为探针,筛选了以载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的猪大肠力Ｐ５５质粒ＤＮＡ文库,得到插入片段约５．５ｋｂ阳性克隆,亚克隆了约０．５ｋｂ含ＳＴ基因的ＴａｑＩ酶切片段,并对该基因核苷酸序列进行了分析。应用竞争性ＥＬＩＳＡ测定了ＳＴ基因在不同启动子调控下的表达情况,在Ｔ７启动子调控下,ＳＴ基因在大肠