嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建及酶切位点分析

[目的]克隆和表达嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,用其构建能承载外源抗原表位的乳酸菌细胞表面展示系统。[方法]以染色体DNA为模板克隆S-层蛋白基因SlpA,通过酶切、连接将其插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et,构建表面展示系统pW425et-S,并对酶切位点进行分析。[结果]将pW425et-S转化入thyA基因缺陷型E.coli X13感受态细胞,SDS-PAGE、Western-blotting、全细胞ELISA检测表明,在重组菌表面表达出S-层蛋白,构建出表面展示系统,确定BstEⅡ作为融合外源保护性抗原基因的酶切位点。[结论]克隆出嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,成功构建表面展示系统pW425et-S,为开发乳酸菌活载体口服活菌疫苗提供了可行性操作平台。     

短小芽孢杆菌胶原蛋白酶基因COla的克隆及序列分析

根据芽孢杆菌(Bacillus)胶原蛋白酶基因序列保守区域设计一对兼并引物,采用PCR法获得胶原蛋白酶产生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus) Col-J株胶原蛋白酶基因保守片段.序列分析表明,该片段与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)基因组序列AL009126中编码胶原蛋白酶基因序列高度同源.参考该序列,获得了短小...     

短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因克隆及功能分析

为了研究短小芽胞杆菌Bacillus pumilus DX01菌株的抑菌相关基因的功能,采用PCR方法从DX01基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建原核表达载体pET2-TasA,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得TasA基因的融合表达蛋白,分别利用悬滴法和平板打饼法检测融合蛋白对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)分生孢子萌发和对玉米小斑病菌及水稻稻瘟病菌菌丝体生长的抑制活性,结果表明TasA融合蛋白对这2种植物病原真菌的生长有着显著的抑制作用。TasA基因包含1个780bp的完整开放阅读框(GenBank:KC692521),编码259个氨基酸残基;该序列与B.subtilis菌株PEBS2501(GenBank::FJ713581)、B.amyloliquefaciens HF-01(GenBank:JF781312)和B.subtilis菌株BWST7003(GenBank:AP012496)同源抑菌蛋白基因序列相似性达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析检测到约32.3kDa的融合蛋白;经Ni-NTA柱纯化后的融合蛋白对供试病原菌均有显著的抑制作用。经测定发酵液的TasA融合蛋白产率为28μg/mL,短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因具有良好的抑菌效果。     

嗜酸乳杆菌NCFM双精氨酸分泌信号肽蛋白的预测分析

[目的]对嗜酸乳杆菌NCFM中Tat途径分泌信号肽蛋白进行预测分析。[方法]以嗜酸乳杆菌NCFM基因组序列为对象,采用Signal P4.0、Lipo P1.0、Tat P软件分析该菌株基因组中的双精氨酸途径分泌信号肽蛋白。[结果]嗜酸乳杆菌NCFM中有酶切位点也有motif的Tat途径信号肽蛋白94个。[结论]对嗜酸乳杆菌NCFM中Tat途径分泌信号肽蛋白的预测分析,为进一步分析该菌胞外蛋白的分泌机制打下基础。     

谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体的构建及强信号肽筛选

强信号肽的使用是提高蛋白分泌效率的关键,筛选强信号肽具有重要的应用价值。本试验以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌基础穿梭载体pAU2为骨架,以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,分别使用强启动子tac-M和谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点一致序列来控制报告基因的转录和翻译,成功构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。分别对来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及谷氨酸棒杆菌中共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增,与pAU20连接,转化谷氨酸棒状杆菌,获得重组信号肽探测载体工程菌株。工程菌株摇瓶发酵培养物上清液AprE酶活测定结果表明,C. glutamicum/pAU20-Vpr、C. glutamicum/pAU20-BprA上清液比酶活分别为180.02和167.6U/mg蛋白质,均显著高于C.glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活(105.09 U/mg蛋白质);C. glutamicum/pAU20-oppA、C. glutamicum/pAU20-Epr、C. glutamicum/pAU20-cgr2063和C.glutamicum/pAU20-ywaD上清液比酶活分别为96.68、86.18、82.52和80.56U/mg蛋白质,均稍低于C. glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活。这些结果表明,信号肽Vpr、BprA、cgr2070、oppA、Epr、cgr2063和ywaD都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。     

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶结构基因的克隆与序列分析

胆盐水解酶主要是微生物在生长和繁殖过程中所产生的代谢产物;具有降低胆固醇的功能.克隆植物乳杆菌中的胆盐水解酶基因并对其序列进行分析.从植物乳杆菌中提取基因组DNA作为模板.根据Genbank上胆盐水解酶全长基因序列(EU477374)设计一对特异性引物,采用PCR扩增技术得到植物乳杆菌中胆盐水解酶基因并对其进行测序.结...     

保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中其基因的DNA序列设计引物,以保加利亚乳杆菌MN株的基因组为DNA模板,利用PCR技术扩增N-乙酰胞壁质酶基因,将其克隆到pMD-19T载体上,进行测序与生物信息学分析。结果表明,MN株N-乙酰胞壁质酶基因序列编码217个氨基酸,与GenBank中公开的N-乙酰胞壁质酶基因核苷酸序列的同源性为98.8%～100.0%;蛋白质的理论分子质量为24.55 ku,理论等电点为9.83;该蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以α-螺旋为主;该蛋白的第16～38位氨基酸残基组成跨膜区,第56～216位氨基酸残基组成LYZ2结构域。研究结果为今后探讨N-乙酰胞壁质酶基因的生物学功能及其功能改造奠定了基础。     

植物乳杆菌Uvs44酪氨酸脱羧酶基因的克隆与序列分析

酪氨酸脱羧酶与发酵食品中酪胺的产生密切相关。根据GeneBank中乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因序列设计一对特异性引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了植物乳杆菌Uvs44酪氨酸脱羧酶的核苷酸序列。结果表明：克隆的酪氨酸脱羧酶基因大小为744 bp,与目前已知的四株乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列比对结果表明：植物乳杆菌Uvs44与Lactobacillus brevis IOEB 9809的亲缘关系最近,为98.3%,与Enterococcus hirae 158的亲缘关系最远,为78.8%,不同乳酸菌的酪氨酸脱羧酶基因之间存在普遍的序列相似性,可为进一步构建酪氨酸脱羧酶基因缺失工程菌奠定基础。     

鼠李糖乳杆菌LGG细胞壁蛋白的预测和功能分析

[目的]采用生物信息学方法预测鼠李糖乳杆菌LGG细胞壁蛋白和功能分析。[方法]以鼠李糖乳杆菌LGG基因组编码蛋白序列为研究对象,采用Phobius和Signal P 4.0软件分析该菌株的细胞壁蛋白,同时采用COG功能数据库对预测的细胞壁蛋白进行功能分析。[结果]鼠李糖乳杆菌LGG基因组中含有41个细胞壁蛋白,这些蛋白的功能分析结果显示,41个细胞壁蛋白中,25个蛋白没有功能注释,16个有功能注释,主要与细胞壁和细胞膜的生物合成,碳水化合物的代谢与转运,蛋白质的翻译后修饰等功能有关。[结论]该研究从结构和功能上分析鼠李糖乳杆菌细胞壁蛋白,为分析益生菌适应环境的分子特征打下基础。     

短乳杆菌JH-1体外降胆固醇机理的初步探讨

[目的]为了初步阐明短乳杆菌Lactobacillus brevis JH-1体外降胆固醇机理.[方法]分析乳酸菌降胆固醇作用的3种可能的机理(同化作用、共沉淀作用和掺入细胞膜).[结果] Lactobacillus brevis JH-1体外降胆固醇与同化作用和掺入细胞膜有关.[结论]初步判定短乳杆菌JH-1体处降胆固醇是同化作用和掺入细胞膜共同作用的结果.     

破壁方法对短乳杆菌谷氨酸脱羧酶提取效果的影响

采用不同的破壁方法提取短乳杆菌谷氨酸脱羧酶（GAD）,研究破壁方法对所得GAD活力的影响。结果表明,超声波破壁有利于菌体释放胞内谷氨酸脱羧酶。正交试验结果表明,超声波破壁的最佳工艺条件为：超声功率220 W,工作时间20 min,工作/间歇时间比5 s/10 s。     

隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptum JF-5分泌蛋白质组的分析

[目的]对隐藏嗜酸菌（Acidiphilium cryptumJF-5）全基因组的3063个氨基酸序列进行预测,分析其分泌蛋白质组的构成。[方法]利用信号肽预测软件SignalPv3.0、跨膜螺旋结构预测软件TMHMMv2.0、RR-motif信号肽预测软件TatPv1.0、脂蛋白质信号肽预测软件LipoPv1.0、非经典分泌蛋白质预测软件SecretomeP和亚细胞定位软件Psortbv2.0.4对Acidiphilium cryptumJF-5全基因组的3063个氨基酸序列进行预测分析。[结果]在隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptumJF-5中有444个蛋白质为分泌蛋白质,其中分泌型信号肽148个,RR-motif亚组型信号肽27个,脂蛋白质信号肽22个,无Prepiplin-like信号肽,非经典分泌蛋白质247个;另外,对分泌型信号肽的长度分布、氨基酸使用频率和酶切位点的氨基酸使用频率作出了统计分析。[结论]研究结果为进一步研究嗜酸菌Acidiphilium cryptumJF-5的基因功能提供了丰富的信息基础。     

乳杆菌乳糖酶的基因异源表达及酶学性质分析

采用简并引物PCR和TAIL-PCR方法,从乳杆菌Lactobacillus sp. B164中克隆得到一个乳糖酶基因bg42-164。基因全长2 031 bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,预测分子量76 kDa,无信号肽序列。将bg42-164连接pET-30a(+)载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后可检测到乳糖酶活力。SDS-PAGE分析乳糖酶BG42-164的蛋白分子量为76 kDa,使用组氨酸标签亲和层析方法进行蛋白纯化,并对纯化的乳糖酶BG42-164进行了酶学性质分析。该酶最适反应温度为50℃,经50℃处理30 min后,剩余酶活力保留80%以上,pH 6.0时该酶的水解活力最高。牛奶水解试验表明,乳糖酶BG42-164对乳糖的水解效果良好,5 mL牛奶中添加250 U酶蛋白,在50℃条件下2 h乳糖水解率为100%。该酶温度范围宽,乳糖水解效果好,为其在低乳糖奶生产中应用奠定了理论基础。     

信号肽优化提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达量

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）广泛用于食品加工、饲料添加剂、生物传感器及工业生产等领域。较曲霉而言,毕赤酵母是更具高效生产GOD潜力的微生物,其副产物少,分离纯化简单。但由于外源基因、基因剂量以及分泌信号等因素的影响,毕赤酵母GOD产量仍然较低,限制了GOD在食品加工等领域的大规模应用。基于毕赤酵母密码子偏好性和mRNA二级结构能量,对毕赤酵母重组表达盒中的α因子信号肽进行改造,得到4种含有不同信号肽的毕赤酵母重组菌株。结果表明,使用含最高密码子频率信号肽α¹重组菌株的GOD酶活力是出发菌株的2.01倍;而使用含低密码子频率信号肽α⁴重组菌株的GOD酶活力仅为出发菌株的41%。综上所述,毕赤酵母表达载体中的信号肽核酸序列排布能够影响重组GOD的表达量,为提高毕赤酵母重组蛋白表达量提供了新的研究思路。     

Optimization of Solid-State Fermentation with Lactobacillus brevis and Aspergillus oryzae for Trypsin Inhibitor Degradation in Soybean Meal

The aim of the present study was to optimize trypsin inhibitor degradation in soybean meal by solid-state fermentation(SSF) with Lactobacillus brevis and Aspergillus oryzae,and to determine the effect of SSF on phytic acid,crude protein,crude fat,and amino acid profile.Response surface methodology(RSM) with Box-Behnken design was used to optimize SSF.The optimal conditions derived from RSM for L.brevis fermentation were:pH=5.1;inoculum size=10%;duration=72 h;substrate to water ratio=1.5.The minimum content of trypsin inhibitors was 6.4 mg g-1 dry matter.The optimal conditions derived from RSM for A.oryzae fermentation were:substrate to water ratio= 0.81;inoculum size=4%;duration=120 h.The minimum content of trypsin inhibitors was 1.6 mg g-1 dry matter.Both L.brevis and A.oryzae decreased trypsin inhibitors dramatically(57.1 and 89.2% respectively).L.brevis fermentation did not affect phytic acid(0.4%) and crude fat(5.2%) considerably,whereas A.oryzae fermentation degraded phytic acid(34.8%) and crude fat(22.0%) contents to a certain extent.Crude protein content was increased after both fermentation(6.4 and 12.9% for L.brevis and A.oryzae respectively).Urease activity was reduced greatly(83.3 and 58.3% for L.brevis and A.oryzae respectively).In conclusion,SSF with A.oryzae and L.brevis reduced trypsin inhibitor content and modified major macronutrients in soybean meal.     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.