赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化(英文)

[Objective] To optimize the prokaryotic expression of MCP gene of red-spotted grouper nervous necrosis virus. [Method] The MCP gene was amplified from red-spotted grouper nervous necrosis viral genome by RT-PCR. The recombinant expression vector pRSET A-MCP was constructed and transformed into BL21(DE3)plysS to express proteins with induction in different media, at different pH, or at different temperatures. [Result] The expression level of recombinant bacteria reached a peak with induction under the following condition: SOB or LB medium, pH 7.0, 37 ℃ while the fusion protein was about 44.5 kD in molecular weight. [Conclusion] This study provided a basis for the development of RGNNV-MCP vaccine.     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。     

松果提取物的体外抗腺病毒活性研究

用95%的乙醇沸腾回流提取,制备松果提取物.MTT法确定提取物对细胞的最大无毒浓度;用梯度滴定法观察腺病毒所携带的绿色荧光蛋白基因的蛋白表达量确定病毒液的效价(TCID50);参照所得数据,设计3个松果提取物潜在的抗腺病毒靶位,分别探究松果提取物对腺病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的抑制作用和对病毒生物合成的抑制作用.结...     

一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。     

2009-2011年市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量评估

为了解目前市售商品化猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的质量,利用TCID50效价测定和RT-PCR 2种方法对2009-2011年市场销售的主要国产疫苗产品进行了检测。结果发现,目前市售的疫苗产品中活病毒含量差异较大,虽然部分产品可达103.80 TCID50/头份,但有些产品含量极低。RT-PCR检测结果与TCID50效价测定的结果基本一致。这表明目前市售的乙脑疫苗质量良莠不齐,部分疫苗的抗原含量可能难以满足生产要求,这为规模化猪场乙脑防控的疫苗选择提供了重要参考依据。     

猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的效价测定及保存稳定性研究

为评估市售商品化猪乙型脑炎(JE)弱毒活疫苗的质量以及实验室条件下疫苗的保存稳定性,采用TCID50效价测定和RT-PCR检测病毒的保守基因(E基因和C/pr M基因)2种方法对2012年市场销售的主要国产疫苗产品进行了质量评估,同时将供试疫苗产品置-30℃保存3、6、9、12个月后分别取样测定乙脑病毒(JEV)TCID50效价。结果表明,市售的猪乙脑同类疫苗中不同品牌产品之间活病毒含量差异较大,最高可达104.33TCID50/头份,但部分产品含量极低,甚至难以检测到活病毒;E基因和C/pr M基因的RT-PCR扩增产物丰度的差异与TCID50测定结果基本一致。多数疫苗产品在有效期内病毒效价基本稳定,同一厂家生产的疫苗保存期越短,其中相对活病毒越多,效价越高。     

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.     

PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc-145细胞的毒力比较

[目的]研究青海PRRSV毒株对Marc-145细胞的适应性和增殖速率以及致病性和毒力等.[方法]以PRRSV青海毒株QH08、海利和诺倍威CH-1R经典毒株、GW-HR毒株及其在Marc-145细胞上的传代毒株为研究对象,对4种毒株及其传代毒株的TCID50值和细胞病变作用(CPE)出现的时间进行比较,探讨了PRRSV青海毒株对Marc-145细胞的适应性、在Marc-145细胞内的增殖速率以及该毒株的毒力.[结果]随着PRRSV传代次数的增加,病毒在Marc-145细胞中的增殖速率加快,对细胞的适应性和毒力都增强.与其他3个毒株相比,青海株毒力最强;C PE出现的时间提前,说明病毒在Marc-145细胞中的复制周期缩短,表明不同毒株PRRSV的F10比F1在Marc-145细胞中具备更好的复制能力和致病性.[结论]4株PRRSV传代毒10个代次的TCID50总趋势为渐变上调的趋势,CPE出现的时间总体上呈逐渐缩短的趋势.     

WSSV单抗的制备及其在红螯螯虾病毒病检测中的应用

将提纯的感染红螯螯虾的WSSV,免疫BALB／c小鼠,三次免疫后取其脾细胞与SP2／0融合．间接ELISA筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,共获得7株针对WSSV的特异性单抗,分别命名为E2、C2、E3、G3、C4、D5以及F10．细胞上清ELISA效价为1：1600—1：6400．抗体亚类鉴定结果表明：E2、G3、C4属于IgG1,C2、D5、F10属于IgG3,E3属于IgG2a亚类;单抗热稳定性试验表明7株单抗均是热稳定的．选取单抗G3和F10进行病毒中和试验,结果表明：在适宜的抗原浓度下,两株单抗均有较好的中和能力．选取单抗G3作为一抗建立了间接ELISA方法,通过对人工感染红螯螯虾WSSV的测定,初步证实该单抗可用于WSSV的检测．     

心包积液-肝坏死综合征高免卵黄抗体的研制

采取心包积液-肝坏死综合征病鸡的肝脏匀浆冻融,接种SPF鸡胚,制备尿囊液灭活水苗,用两种免疫程序对产蛋鸡进行免疫,用琼脂扩散试验检测其卵黄抗体水平,制备高免卵黄抗体。经中和试验和临床试验,结果显示高免卵黄抗体对该病的预防和治疗效果明显。     

6株鱼类病毒性神经坏死病病毒cp基因的分子特征和遗传发生分析

根据已报道的鱼类病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV)衣壳蛋白基因(coat protein gene, cp基因)设计引物,对2006年从我国沿海养殖石斑鱼中分离到的6株鱼类神经坏死病毒进行RTPCR扩增,特异性扩增出6株病毒的完整衣壳蛋白基因,分别连接到pMD18-T载体中,并进行序列测定和分析.结果发现,6个VNNV分离株的cp基因核苷酸序列的同源性在97.3%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%～99.1%之间.根据cp基因核苷酸序列绘制分子进化树,发现6个VNNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近.试验结果表明,目前我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中广泛传播流行.     

氯胺酮完全抗原的制备及免疫效果检测

基于盐酸氯胺酮是一种化学反应性质活泼的小分子,利用半抗原-载体效应的免疫学原理,以三氯化磷（PCl3）为桥梁,将盐酸氯胺酮分子共价连接到兔血清白蛋白（RSA）分子,随后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析偶联物,并用该偶联物免疫BALB/c小鼠,最后采用斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）检测氯胺酮抗体应答水平。蛋白电泳分析显示已成功制备出分子量约为78.8 ku、氯胺酮与RSA的分子偶联比为39的完全抗原,能诱导实验小鼠产生效价为1：1 280的抗氯胺酮抗体。本试验不仅建立了检测氯胺酮的血清学方法,还为开发氯胺酮戒毒疫苗做了有益的积累。     

新城疫病毒感染宿主免疫应答及其抗肿瘤作用的研究进展

新城疫病毒基因组编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白,病毒蛋白与病毒毒力密切相关。病毒入侵宿主时,宿主通过诱导天然免疫应答和特异性免疫应答抵御病毒入侵。此外,新城疫病毒通过刺激机体免疫系统,可特异性杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞损伤甚少,具有抗肿瘤作用。从新城疫病毒的毒力划分、病毒结构蛋白与毒力的关系及宿主的免疫应答、病毒抗肿瘤作用4个方面进行综述与讨论,以期为深入研究新城疫病毒的致病性,进一步防控以及利用新城疫病毒进行肿瘤治疗奠定基础。     

微生态制剂对猪免疫应答及生长性能的影响

挑选120头长大二元杂交断奶仔猪,进行微生态制剂对猪免疫应答及生长性能的影响研究。结果显示,微生态制剂具有激活猪体免疫机能、增强免疫应答、提高猪瘟疫苗免疫抗体水平的显著功效(P<0.05);还能极显著降低呼吸道疾病、腹泻病的发病率(P<0.01),显著提高猪的生长性能水平(P<0.05)。     

马铃薯甲虫RNA干扰高效致死基因的筛选

【目的】基于备选基因RNA干扰后的致死效果评价,筛选出高效致死基因。【方法】通过在赤拟谷盗中已的报导和相似性搜索获得马铃薯甲虫致死基因Ldpp1alpha-96a、LdRpt3、Ldalpha snap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRop、LdGawky、Ldshi、Ldcact、Ldinr-a,以及阳性对照基因LdATPaseA和LdATPaseE,构建dsRNA表达载体,经饲喂马铃薯甲虫二龄幼虫不同浓度的dsRNA,分析对幼虫的20%取食剂量AD₂₀、化蛹中量PD₅₀和幼虫7 d致死中量LD₅₀ ,经分析和评估,筛选出高效致死基因。【结果】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫的 AD₂₀ 在1.18±0.10(μg / mL)~ 61.07±10.17(μg / mL);PD₅₀ 在0.06 ±0.01(μg / mL)~ 31.20 ±1.89(μg / mL);LD₅₀ 在1.39±0.13(μg / mL)~ 228.13±6.72(μg / mL)。其中 AD₂₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdRpn6 ;PD₅₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdGawky;LD₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、Ldsrp54k。【结论】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫均有一定的抑制取食、抑制化蛹及致死活性。其致死活性随浓度增高而增大,表现出剂量依赖效应,与对照组存在显著差异。通过综合比较AD₂₀和LD₅₀,Ldalpha snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3个基因的毒力较ATPaseE和ATPaseA更强,具有较高的生物活性。提出并推荐AD₂₀和LD₅₀是评价备选基因dsRNA对幼虫致死效果的关键指标。     

传染性牛鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及其应用

采用改进的融合技术得到318个杂交瘤细胞系。经ELISA筛选,这些细胞系所分泌的抗体均和病毒抗原发生反应。亚克隆出26个杂交瘤细胞系,制出特异的单克隆抗体,并采用ELISA、放射免疫沉淀试验(RIPA)、SDS-PAGE、免疫印迹及病毒中和试验等对单克隆抗体的特性作了鉴定。应用单克隆抗体对牛疮瘆病毒Ⅰ型Bovine HerpesVirus I(BHV—Ⅰ)主要结构蛋白作了分析。     

Evaluation of the Pathogenicity of a Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Variant in Piglets

Since May 2006,a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) variant characterized by 30 amino acids deletion within its NSP2-coding region emerged and caused extensive economic losses to China's pig industry.To investigate the in vivo pathogenicity and immune responses of the newly emerging PRRSV,3 groups of 60-d-old conventional piglets were inoculated intranasally with a representative strain of the HP-PRRSV variant HuN4 with 3 different infection doses (3× 103-3× 105 TCID50).The results revealed that the virus variant caused severe disease in piglets and the significant clinical characteristics consisted of persistently high fever (41.0-41.9℃) and high morbidity and mortality (60-100％),the marked clinical signs of PRRS and severe histopathogenic damages in multiple organs.It induced rapid and intense humoral immune responses and seroconversion was detected in most infected pigs at 7 d post-infection (DPI).The virus vigorously replicated in vivo and the highest virus average titer was 9.7 log copies mL-1 serum at 7 DPI.Elevated levels of IFN-y and IL- 10 cytokine production in serum in this study were also observed.Taken together,our results demonstrated that the HP-PRRSV variant HuN4 strain is highly pathogenic for piglets and suitable to be a reference strain of highly virulent PRRSV for evaluating the efficacy of the new vaccines.     

不同因素对抑制素基因免疫肉牛反应性的影响

为探讨佐剂、质粒纯度和免疫次数3种因素对抗抑制素抗体效价的影响，以分析抑制索基因免疫是否使内牛产生免疫应答，利用已构建的抑制索真核融合表达质粒pCISI对内牛进行了免疫试验．结果表明，抑制素pCISI基因免疫内牛后佐剂处理组比无佐剂组免疫效果明显．对抗体P/N（待测血样的吸光值P与阴性血样吸光值N的比值）来说，普鲁卡因佐剂显著优于脂质体，但就抗体阳性率来说，普鲁卡因和脂质体差异不显著．无论是抗体P/N值还是抗体阳性率，高纯度组的效果略高于低纯度组，但差异不明显．随着免疫次数的增加抗体P/N值和抗体阳性率均升高，两者差异显著，说明了抑制素基因免疫内牛可诱导产生抗抑制素抗体，纯度对抗体的产生和抗体阳性牛比例没有影响，但免疫佐剂与免疫次数有影响．     

鸭坦布苏病毒感染对鸭免疫器官指数和体液免疫的影响

鸭坦布苏病毒是近年来在我国发现的可引起种（蛋）鸭高热、采食量和产蛋量骤降的新病毒。本研究以麻鸭为动物模型,测定麻鸭感染鸭坦布苏病毒后,其免疫器官指数、重组H5亚型禽流感病毒灭活疫苗和鸡新城疫病毒弱毒活疫苗诱导产生的抗体水平。结果表明,鸭坦布苏病毒感染会侵害麻鸭的免疫器官,第1～3d脾脏明显肿大,第7～10d试验组胸腺指数极显著低于对照组,第1～14d法氏囊出现萎缩;与仅免疫疫苗的对照组鸭相比,感染鸭坦布苏病毒后再注射疫苗的试验组鸭产生抗体的时间延迟、抗体的峰值降低,抗体下降加快,且在整个试验期内产生的抗体水平均低于对照组鸭的抗体水平,表明鸭坦布苏病毒感染可抑制鸭对灭活疫苗和弱毒疫苗的体液免疫应答能力。     

小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

[目的]为初步评价五氯柳胺的安全性,对其进行小鼠的急性毒性试验。[方法]预试验采用递增法确定给药的剂量范围和正式试验分组。正式试验采用简化寇氏法,灌胃给药,观察7 d,观察给药后小鼠的体征变化,统计死亡率和死亡时间,计算LD50值及其95%置信区间。[结果]小鼠口服五氯柳胺的LD50为1.130 g/kg,95%置信区间为0.940~1.359 g/kg。[结论]按照化学物的急性毒性剂量分级,五氯柳胺为低毒化学物。