农杆菌介导法将Bt杀虫蛋白基因导入玉米自交系的研究

利用β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因的瞬时表达和稳定表达对农杆菌转化玉米愈伤组织的条件进行优化,通过用带有Bt抗虫基因和bar抗除草剂基因的根癌农杆菌LBA4404(ACT)转化玉米自交系7922、H99和P2的胚性愈伤组织,获得了抗性愈伤组织,并分化出植株,PCR检测初步证明Bt杀虫蛋白基因已整合到玉米再生植株中。     

玉米愈伤组织的耐盐性筛选

以玉米(Zea mays L.)自交系H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织为材料,利用农杆菌介导的方法将带有p CAMBIA1301-BADH抗盐碱基因转入供试品种的胚性愈伤中,通过愈伤组织对盐(NaCl)的敏感性试验,确定愈伤组织适宜选择压,同时研究了2,4-D浓度对筛选结果的影响。结果表明,玉米自交系H99在盐筛培养基中NaCl浓度为200 mmol/L,2,4-D浓度为1.0 mg/L时筛选结果最佳。对移栽成活的48棵抗盐转p CAMBIA1301-BADH基因植株,经PCR检测有3株呈阳性,阳性株率达到6.3%,初步证明目的基因已整合到玉米基因组中。     

应用农杆菌介导法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究

以玉米自交系“综31”和“P12”的胚性愈伤组织为材料，通过愈伤组织对潮霉素的敏感性试验，确定了潮霉素50～70mg／L为愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达栽体导入玉米自交系中，并对农杆菌转化系统的条件进行了研究。结果表明：采用EHA105的菌株振荡20h后，菌液OD值为0．5～0．6时侵染25min为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR检测，证明外源目的基因已整合到玉米基因组中，转化率最高达到5．3％，并得到了转化植株的种子。     

农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化菊花的研究

以菊花愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法,利用番茄红素β-环化酶基因(LycB)对菊花进行转化,以抗性愈伤率为指标,探讨了侵染时间、共培养时间、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对转化的影响,建立了LcyB基因转化菊花的遗传转化体系。结果表明：农杆菌侵染菊花愈伤组织的最佳时间为5min;农杆菌菌液浓度OD600值0．55;愈伤组织与农杆菌共培养的时间以3d效果最好;添加AS可提高抗性愈伤率,适宜的AS浓度为100μmol／L;采用Hyg浓度由低到高的筛选方式可有效提高抗性愈伤率;PCR分子检测初步证明目的基因LycB已转入菊花愈伤组织中。     

玉米胚性愈伤组织的遗传转化及耐草甘膦植株再生

以优良玉米自交系X2211的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法将来自微生物荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2菌株的抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米愈伤组织细胞,转化后的细胞经草甘膦筛选,获得抗性愈伤组织并再生植株282株,成活86株,经特异PCR检测表明其中26株植株转入了2mG2-epsps基因,喷施0.125%除草剂试验检测表明,转基因植株具有良好的耐除草剂特性,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的亲本材料。     

农杆菌介导小麦HMW-Glu(5+10)基因转化研究

以含有HMW-Glu(5 10)基因的农杆菌(EHA 105)对豫麦18号幼胚愈伤组织进行了遗传转化,得到的6株转基因再生植株.经PCR初步检测,发现有2株的基因组中5亚基基因呈现阳性,其中1株的基因组5亚基和10亚基基因均呈现阳性.表明目的基因可能已经整合到了受体基因组中.同时对影响农杆菌介导遗传转化的几个重要因素进行了探讨,发现乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol.L-1、菌液OD600值为0.5、侵染时间为1 h、侵染后对愈伤组织适当干燥处理等可有效提高农杆菌的转化效率.     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

利用农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化,研究了不同影响因子对玉米遗传转化效率的影响。结果表明,相比自交系H99,玉米杂交组合H99×A188更适宜作为玉米遗传转化的受体材料;继代6d后的胚性愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染效果好于EHA101;抗性愈伤组织筛选培养基中除草剂筛选的临界质量浓度为4.0mg/L;头孢霉素质量浓度在500mg/L时适合进行除菌处理,且对植株再生影响较小。     

农杆菌侵染条件对玉米单倍体遗传转化的影响

以玉米诱导系HHI69诱导玉米自交系获得的单倍体愈伤组织为受体材料,GUS基因为报告基因,采用农杆菌介导法进行遗传转化,对影响转化效率的侵染条件进行了研究。结果表明:继代8 d后的愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染力好于LBA4404;侵染液浓度OD_(600)为0.7、侵染时间为30 min时,GUS瞬时表达率最高,达到了65.31%。     

BIBAC2载体转化水稻的研究

双元细菌人工染色体(BIBAC)载体具有克隆大片段DNA构建文库和农杆菌介导转化植物的双重功能.利用BIBAC载体,在双子叶植物烟草和番茄中已实现了大片段DNA的转移,但在单子叶植物中的应用还未见报道.本研究利用不同水稻基因型、不同农杆菌菌株,对水稻进行了BIBAC2载体的转化研究.水稻成熟胚诱导愈伤组织经过1~2次继代培养,在含乙酰丁香酮的N6培养基上预培养3 d,在含BIBAC2载体的农杆菌中侵染10 min,26℃下共培养3 d.感染后的愈伤组织在含25~50 mg/L潮霉素培养基上经过4~8周的筛选,共得到了66株抗性再生植株.通过对抗性植株中GUS基因的组织化学染色检测,NPTII基因的PCR检测和ELISA检测,HYG基因的PCR检测,确认2株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花15号愈伤组织,1株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花8号愈伤组织,转化率分别为2.9%和0.9%.结果表明,BIBAC2载体已被成功导入了水稻基因组中,转化效果EHA105菌株优于C58C1菌株,中花15号、中花8号优于中花10号和中花11号.结果还表明,利用三亲交配法可以将大于23.5 kb的载体转化到农杆菌中.初步建立了BIBAC2载体转化水稻的技术体系,为利用BIBAC系统向水稻转入大片段DNA和多个外源功能基因奠定了基础.     

根癌农杆菌共培养转化谷子技术体系的建立

分析了影响农杆菌共培养转化谷子的因素,初步建立的谷子农杆菌共培养适宜转化体系为:以幼穗诱导的愈伤组织为转化材料,农杆菌浓度OD_(600)为0.5,已酰丁香酮为100μM,浸菌附加超声波或真空处理,22℃共培养2～3d后水洗2遍,于含羧苄西林钠和头孢唑林钠各250mg/L的0.1％甘露醇浸泡30min除菌,接于选择培养基上进行筛选并继代和再生,最后于1/2MS中生根成为完整小植株。用含Bt基因的双元裁体农杆菌LBA4404和EHA101,按所建立的转化程序,对豫谷1号、高39、鲁谷10号等优良品种的愈伤组织进行了转化。共获致密型抗性愈伤组织75个,经再生获得35株抗性植株。     

一种利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系的研究

[目的]利用花粉管结合农杆菌介导方法将iaaM基因导入玉米自交系。[方法]利用电击转化法将iaaM基因的表达载体转入农杆菌LBA4404菌株中,通过花粉管通道法将验证正确的菌株直接转化京24玉米自交系,最后通过除草剂筛选及PCR检测得到阳性植株。[结果]试验共得到12株抗性植株,其中10株为阳性植株。[结论]该研究成功建立了一种无需组织培养体系,直接利用花粉管通道进行农杆菌介导的玉米转化方法。     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

农杆菌介导bar基因转化玉米幼胚的研究

通过农杆菌介导法,采用抗除草剂基因(bar)转化3个玉米自交系的幼胚,并对遗传转化影响因素进行优化。结果表明,2,4-D浓度为2 mg·L-1时,胚性愈伤组织诱导率较高;农杆菌最佳的侵染时间为20 min;乙酰丁香酮(AS)明显提高了幼胚的GUS瞬时表达频率,适宜浓度为200μmol·L-1;温和选择方法适于幼胚转化,不定芽诱导培养基、芽伸长培养基和生根培养基中潮霉素的浓度分别为8、6、2 mg.L-1;获得7株PCR检测以及除草剂抗性试验阳性植株。     

农杆菌介导玉米幼胚愈伤组织遗传转化体系的优化

以玉米骨干自交系‘郑58’的幼胚为材料,用农杆菌介导法对诱导培养出的胚性愈伤组织进行三价植物表达载体的遗传转化,同时对影响转化效率的主要因素进行研究.结果表明,当浸染液和共培养培养基中乙酰丁香酮(AS)的浓度为150mg·L-1时,抗性愈伤组织获得率显著提高17.39%;在菌液浓度D600为0.3、浸染时间为20min、共培养时间为60h、共培养温度为22℃、共培养培养基pH为5.4以及头孢霉素浓度为400mg·L-1的试验体系下,有利于提高玉米抗性愈伤组织的获得率,其获得率最高可达17.26%.     

农杆菌介导的玉米自交系愈伤组织的转化

以农杆菌LBA4 4 0 4介导将外源基因导入玉米骨干自交系齐 319、掖 5 15、掖 5 0 2等胚性愈伤组织 ,并由筛选出的抗性愈伤组织再生出可育植株。农杆菌浓度、共培养时间和玉米的基因型显著影响农杆菌介导的玉米愈伤组织的转化率。农杆菌的浓度OD60 0 0 5～ 0 7,共培养时间 3～ 4天时转化率较高。在相同条件下不同基因型的玉米胚性愈伤组织的转化率为 3 3%～ 10 %。     

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

 由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 ,观察到转基因植株抗渗透胁迫能力增强     

农杆菌介导小麦愈伤组织转化的研究

利用衡水地区小麦推广品种, 取小麦种子的成熟胚进行愈伤组织培养, 用携带有小麦耐盐相关基因的根癌农杆菌 EHA 105侵染, 经筛选后, 获得新生的转基因愈伤组织, 旨在为进一步获得转基因小麦植株奠定基础.     

Studies on Genetic Transformatiom of Embryogenic Suspension Cultures of Sweetpotato

Genetic transformation of embryogenic suspension cultures of sweetpotato cv. Lizixiang wasconducted by using Agrobacterium tumefaciens strain A208SE harboring the binary vectors pROA93 with β-glucronidase (GUS) and neomycin phosphotransferase (NPT Ⅱ ) genes. The results indicated that embryogenicsuspension cultures precultured for 1 -3 d were suitable for the transformation. The optimal cocultivation timewas 4 - 5 d. The optimal concentration of kanamycin was 50-75 mg L-1 for suspension culture and 100 mg L-1for embryogenic callus proliferation and plant regeneration. The optimal concentration of carbencillin was 100mg L-1. Transgenic plants identified with GUS assays and PCR analyses were obtained.     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。