养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

养殖大菱鲆肠道中大菱鲆弧菌的分离鉴定及药敏试验

2014年11月,大连地区某大菱鲆养殖场发生病害并伴有死亡,主要症状为吻部下颌明显出血,腹腔积水,肝脏充血,肠道出血有白便。从患病大菱鲆肠道中分离出1株可在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基上生长的菌株HZ-C1,人工回接感染试验证明其对健康大菱鲆具有较强致病性。通过形态学观察、16SrDNA序列同源性分析及生理生化试验确定菌株HZ-C1为大菱鲆弧菌。药敏检测结果显示,大菱鲆弧菌HZ-C1对氯霉素、丁胺卡那及头孢曲松等11种抗生素敏感,但对青霉素、四环素及诺氟沙星等15种抗生素耐药。本研究为大连地区养殖大菱鲆细菌性病害防治提供了一定病原学依据。     

条石鲷出血病病原的分离与鉴定

从患刺激隐核虫继发感染出血病的条石鲷上分离到2株细菌L1和L2,人工感染实验证实L1和L2均对条石鲷具有高致病性。对菌株L1和L2进行了形态和生理生化鉴定,结果表明L1和L2为同一种细菌,为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖,氧化酶阳性,在无盐NaCl胨水中不生长,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性,精氨酸双水解酶、精氨酸脱羧酶阴性;发酵葡萄糖产酸不产气;硝酸盐还原、明胶酶为阳性;利用葡萄糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖,不利用阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖、肌醇、枸橼酸盐、水杨素等;七叶苷、MR为阴性,VP阳性,产生吲哚,不产生H2S,可鉴定为溶藻弧菌。     

养殖大菱鲆中牙鲆肠弧菌的分离鉴定及组织病理学

2007年1月,山东省胶南某养殖场人工养殖的大菱鲆（Scophthalmus maximus）发生严重病害并大批死亡。病鱼的主要症状是体表溃疡,腹腔积液,肠道肿胀,肝脏萎缩,胆囊暗绿色等。从病鱼胆囊中分离纯化得到优势菌株,命名为da3。人工感染试验证实,该菌株对大菱鲆有较强的致病性。对体重为25 g的大菱鲆的半数致死量为每尾鱼2×106 cfu。通过细菌16S rDNA序列测定及形态学和生理生化特征研究确定,该病原菌为牙鲆肠弧菌（Vibrio ichthyoenteri）。组织病理学观察表明,病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道和脑的微观结构发生了明显的病理变化,由此引起的器官功能衰竭可能是病鱼死亡的主要原因。本文结果对大菱鲆细菌性病害的控制具有参考价值。     

患白点病条石鲷继发感染出血病病原的分离与鉴定

从患刺激隐核虫继发感染出血病的条石鲷上分离到2株细菌L1和L2,人工感染实验证实L1和L2均对条石鲷具有高致病性。对菌株L1和L2进行了形态和生理生化鉴定,结果表明L1和L2为同一种细菌,为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖,氧化酶阳性,在无盐NaCl胨水中不生长,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性,精氨酸双水解酶、精氨酸脱羧酶阴性;发酵葡萄糖产酸不产气;硝酸盐还原、明胶酶为阳性;利用葡萄糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖,不利用阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖、肌醇、枸橼酸盐、水杨素等;七叶苷、MR为阴性,VP阳性,产生吲哚,不产生H2S,可鉴定为溶藻弧菌(V.alginolyticus)。     

养殖大菱鲆鳗弧菌疾病的初步研究

从某养殖场患病的大菱鲆病灶和肝肾等组织分离到一株病原菌YC-01,经人工感染健康大菱鲆后,其皮下、鳍基部、及口部皮下出血,皮肤溃烂、腹部膨胀等,与自然发病大菱鲆的症状相同.药敏实验结果表明,菌必治、氟哌酸、呋喃妥因、复达欣、红霉素、卡那霉素,对YC-01有较强的抑制作用,该菌株对四环素、磺胺类、青霉素等抗生素有耐药性.经过光镜和电镜的综合形态观察,生理生化特征测试,标准菌种比对等,可将病原菌CY-01鉴定为鳗弧菌.     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护试验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110～150g的大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109cfu/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示,第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果

将鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）分别用0.3%福尔马林灭活,制备成鳗弧菌和溶藻弧菌2种单苗,并将2种菌等量配制成二联疫苗,单次腹腔注射免疫大菱鲆（Scophtalmus maximus）.通过检测免疫后替代途径补体活力、溶菌酶活力、抗体凝集效价的变化并分别进行攻毒实验比较疫苗的免疫效果.结果显示,3种疫苗对所测定的各免疫指标都有一定的促进作用,但二联疫苗后期效果低于2种单苗.二联疫苗对鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为83.52%和83.24%,而鳗弧菌单苗对鳗弧菌攻毒、溶藻弧菌单苗对溶藻弧菌攻毒的免疫保护率分别为80.37%和74.89%.可以认为2株菌具有制备二联疫苗的可能性.[中国水产科学,2006,13（3）：397-402]     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护实验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110~150g大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109CFU/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示:第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

大菱鲆育苗期细菌病的防治

在2003年的大菱鲆育苗生产中，我们对大菱鲆幼体发育阶段细菌病的发生与防治进行了初步探索，有效提高了大菱鲆的育苗成活率。现将试验情况报告如下：     

副溶血弧菌对养殖大菱鲆致病性研究

从患出血症的大菱鲆体内分离到5株菌,编号为L-0603314、L-0603442、L-0603431、L-0603121、L-0603241。采用肌肉注射的方法进行人工感染,每尾注射0.05 ml,菌浓度为108cfu/ml和109cfu/ml;采用K-B法用青霉素、环丙沙星、四环素、呋喃妥因、红霉素、庆大霉素、链霉素7种药敏纸片对确定病原性的菌株进行抗生素敏感试验,同时进行生理生化特性研究。结果显示,L-0603121菌株为3.0×108cell/ml时只引起个别试验个体轻微症状,1.0×109cell/ml可造成100%感染率,40%死亡率,可确定L-0603121菌株为引起大菱鲆出血症的致病菌株。药敏试验表明,L-0603121株菌对庆大霉素、红霉素、链霉素、呋喃妥因敏感。根据形态观察、生理生化特征等试验结果,确定L-0603121株菌为副溶血弧菌。     

Identification and Detection of the Pathogenic Bacteria Responsible for Swollen Abdomen Disease in Cultured Turbot,Scophthalmus maximus,and Flounder,Paralichthys olivaceus

Swollen abdomen disease (SAD) seriously threatens the aquaculture of turbots and flounders. Two dominant bacterial strains, FS1 and FS2, were isolated from the livers and kidneys of fish with diagnosed SAD. Applications of biochemical analyses, sequence analyses of 16S ribosomal RNA gene and heat shock protein 60 gene revealed two distinct pathogenic bacterial species, Edwardsiella tarda and Vibrio alginolyticus. These two hypothesized SAD‐causing pathogens were validated by challenge trials on flounder, Paralichthys olivaceus. Challenges with E. tarda and V. alginolyticus demonstrated lethal dose 50 (LD₅₀) values at 1.51 × 10⁵ colony‐forming units (CFU) and 1.05 × 10⁵ CFU, respectively. To develop a rapid SAD diagnosis method in flounders and turbots, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay method was developed to simultaneously detect E. tarda and V. alginolyticus. Our multiplex PCR assay successfully detected as low as 10⁵ CFU/mL E. tarda and V. alginolyticus in flounders and turbots. No other common fish pathogens were detected with the multiplex PCR, suggesting a high specificity of this assay. The multiplex PCR assay developed in this study showed a great reliability in detecting SAD‐causing bacterial pathogens. Further optimization of this assay may contribute to the development of a novel SAD diagnosis tool in aquaculture.     

养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

大菱鲆的摄食量与排空速率的初步研究

以常规实验生态方法,研究商品鱼养殖中大菱鲆的摄食量与排空率,得出个体体重约(420±65)g,在(18 6±0 5)℃日投喂1次的条件下,摄食量为15～30g/尾,平均摄饵量为(41 03±1 71)g/(kg·d),空胃率约11%,在同样条件下的排空周期约20h,初始排粪出现在投食后6h,排泄速率高峰出现于12～14h,排粪量为0 77～1 35g/(kg·h)。建议在适温期中,以鲜杂鱼为饵料的该鱼养成期的合理日投饵1次,投喂量以体重的4%为宜。     

大菱鲆脾肾结节病病原菌的分离和鉴定

2017年夏季,江苏省连云港市某养殖场大菱鲆出现大规模死亡,发病鱼体表无明显症状,解剖可见脾脏、肾脏出现白色散在结节,从发病鱼的内脏中分离得到1株优势菌SM-Myco001。人工感染实验结果显示,SM-Myco001可以引起大菱鲆内脏结节症状并造成鱼类死亡,且在高养殖水温(22℃)条件下发病更为剧烈。生理生化鉴定和16S rRNA基因分析结果显示,SM-Myco001属于海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)。本研究首次报道了我国养殖大菱鲆感染海分枝杆菌的病例,可为大菱鲆养殖过程中的疾病防控提供参考。     

氨氮急性胁迫对大菱鲆幼鱼的毒性效应

本研究采用96 h半静态毒性实验方法,研究了氨氮对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼的急性毒性效应和血浆生理指标的影响。结果显示,在水温为(19.0±0.5)℃、pH为7.85、盐度为29.5和溶解氧为(7.8±0.2) mg/L的环境条件下,平均体重为(163.90±15.31) g的大菱鲆幼鱼,总氨(TAN)和非离子氨(NH3-N)96 h的半致死浓度(LC50)分别为39.73和0.64 mg/L。氨氮浓度、暴露时间及二者交互作用对血浆肾上腺素(EPI)、皮质醇(Cortisol)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、碱性磷酸酶(AKP)和血糖(GLU)含量/活性都存在显著影响;血浆EPI、SOD、GSH、AKP和GLU随氨氮浓度升高响应时间提前,EPI、皮质醇、AKP和GLU随暴露时间延长总体呈现先升后降的趋势;致死高浓度胁迫(TAN浓度70.96和84.11 mg/L)下,血浆SOD和GSH在胁迫期(12 h)内快速升高,GLU快速升高(4 h)后急剧降低(12 h),暗示氨氮急性致死的原因与氧化应激损伤、生理代谢紊乱和呼吸功能受损有关。本结果可为大菱鲆大规格幼鱼的养殖管理和行为数值模拟提供基础资料。     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)鱼苗视网膜组织结构与视觉特性

采用石蜡连续切片技术研究了初孵至50日龄大菱鲆(Scophthalmus maximus)鱼苗的视网膜结构及视觉特性.测定了鱼苗发育过程中视网膜横切面上视锥细胞(CC)、外核层细胞核(ONN)和神经节细胞(GC)的数量变化,以及鱼苗经明暗适应后视网膜色素指数的变化.结果显示,2日龄仔鱼视网膜上出现色素层和视锥细胞层,为仔鱼开口摄食提供了视觉基础.5日龄仔鱼的视网膜没有运动反应.鱼苗从16日龄发育到30日龄,明暗适应后视网膜色素指数的差值显著升高(P＜0.01),表明视网膜出现了显著的运动反应.16-39日龄,鱼苗视网膜上CC、GC数量显著减少(P＜0.01),ONN数量显著增多(P＜0.01),39-50日龄,视网膜上CC、GC和ONN数量没有出现显著差异(P＞0.05).大菱鲆鱼苗变态前视网膜视敏度高,光敏性低,变态后视敏度降低,光敏性增强,视网膜逐步适应感受弱光的刺激,这与大菱鲆鱼苗变态后从浮游到底栖的生活习性相适应.变态后的大菱鲆光感受系统不发达.