用大肠杆菌(Escherichia coli)表达诺如病毒P粒子

为了研制番茄口服疫苗,按番茄偏爱密码子设计合成了编码诺如病毒(Norovirus,NVs)VA387毒株P粒子(P particles)基因PGENE(1039 bp),并在该基因5′端添加了编码His-tag(6×His)的DNA序列.将构建的原核表达载体pMAL-c2-PGENE导入大肠杆菌(Escherichia...     

病毒样颗粒疫苗的研究进展

病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs)疫苗通过表达病毒的结构蛋白组装形成与病毒相似的蛋白粒子结构,模拟病毒进入机体的过程,激活机体的免疫反应,从而达到抵御病毒的目的。VLPs疫苗凭借其高效安全的特性逐渐成为疫苗制备的热门选择。对VLPs疫苗的分类、优势、表达系统、组装纯化、鉴定方法、免疫通路、疫苗修饰等方面的研究进行综述,以期对VLPs疫苗的研究提供参考。     

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏茵ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为栽体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性,重组ZJ111/pCI-IL-2茵能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P＜0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.     

植物基因工程疫苗研究进展与前景展望

可口服免疫(oralimmunization)绿色疫苗(greenvaccine)研究是植物基因工程与分子医学相结合而发展起来的新的研究方向。对当前植物基因工程疫苗的研究方法、疫苗的作用机理进行介绍,总结近10年来国内外植物基因工程疫苗研究进展,并对未来发展做出展望。     

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。     

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白体外表达技术研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原。一般情况下,PCV2感染会导致被感染猪免疫力下降,造成严重的免疫抑制,引起多种病毒或细菌的混合感染或继发感染,给疾病诊断和治疗带来巨大困难。目前,兽医临床上防控PCVAD的最有效手段仍然是疫苗免疫接种,尤其以衣壳蛋白(Capsid,Cap)为靶抗原研制的PCV2基因工程疫苗备受青睐。然而,能够获得大量、可溶性、富有活性的PCV2 Cap蛋白是成功研制该疫苗的关键。综述了近些年来国内外学者利用大肠埃希菌、酵母、病毒活载体和细菌活载体等体外表达系统表达PCV2 Cap蛋白的研究进展,以期为今后PCV2快速检测技术研究和PCV2基因工程疫苗的研制提供参考。     

犬细小病毒病DNA疫苗的研究进展

犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性的烈性传染病。近年来,在犬细小病毒新型疫苗研究方面取得了新的进展,特别是DNA疫苗,笔者就犬细小病毒DNA疫苗的作用机理、抗原基因、载体选择、分子佐剂的研究进展方面进行系列论述。     

珊瑚豆花叶病病原病毒鉴定

从珊瑚豆(Solanum pseudocapsicum L.var diflorum(Vell)Bitter)花叶病株上分离到一病毒(SPV—I),汁液摩擦接种和桃蚜(Myzus persicea)、棉蚜(Aphis gossypii)均能传毒。两次试验证明该病毒不经种传,人工摩擦接种可侵染7科中的21种植物。在黄瓜、心叶烟等植物上能引起系统花叶,能引起苋色藜、昆诺阿藜接种叶片局部枯斑。该病毒钝化温度为65～70℃10分钟;稀释限点为10~(13)～10~(-4);体外存活期为1～2天(22℃)。琼脂免疫双扩散表明,此病毒与黄瓜花叶病毒有明显的血清学关系。浸蘸法制备样品,2%醋酸铀负梁,透射电镜观察,该病毒粒子为正二十面体,其直径为28～30nm。根据此病毒的生物学、血清学特性和病毒粒子的形态特征,初步认为该分离物是黄瓜花叶病毒的一个株系。     

植物基因工程疫苗的研究进展

植物基因工程疫苗是利用植物表达重组抗原蛋白来生产疫苗。作阐述了用转基因植物生产疫苗的基本原理和方法以及植物疫苗的优点，特别是食用疫苗的研究进展、优缺点及其应用前景。     

牙龈卟啉菌菌毛基因在转基因番茄果实中的特异表达及小鼠免疫实验

将编码牙龈卟啉菌菌毛蛋白（Fimbrillin,FimA）（第266-337Aa）与霍乱毒素B亚基（CTB）基因用农杆菌侵染法转入番茄植株,并利用番茄果实特异启动子E8使其在果实中实现特异表达,然后用特异表达的转基因番茄果实对实验小鼠进行口服免疫实验,研究转基因番茄果实的免疫原性。实验结果表明：获得的11株转化植株中,共有9株重组了CTB-FimA基因的植株在番茄果实中实现了特异表达;口服转基因番茄果实的免疫小鼠的血清中检测到抗FimA抗体;获得了以CTB为佐剂的在番茄果实中特异表达牙龈卟啉菌菌毛基因的植物口服疫苗候选植株。     

番茄基因工程的研究进展

文中概述了近几年来番茄基因工程方面的研究进展。其中番茄基因组精细序列分析的完成是这一领域得以快速发展的基础。在育种方面,利用转基因技术生产出了具有各种抗性的番茄植株,获得了具有优良品质的新品种。同时,基因工程手段拓展了番茄在医学上的应用。目前研究人员已利用番茄生产药用蛋白、抗体、口服疫苗、病毒转基因番茄疫苗,并且对番茄红素的研究有望推动对癌症基因疗法的研究。总之,利用基因工程手段,有望使番茄成为集治疗、营养和免疫于一身的新型蔬菜。     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因(GenBankIDM87659,1993)序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

植物疫苗技术在番茄上的应用效果

根据多年栽培试验,应用植物疫苗可以提高地温、活化土壤养分、改良土壤,提高番茄植株的抗性,减少农药、化肥使用量,促进棚室番茄植株生长,提高品质,产量增加24.75%,每公顷增收6.8万元,增收幅度高达23.0%,使用植物疫苗在冬棚西红柿生产上有着广阔的前景。     

中、碱性土壤条件下黄腐酸与磷肥配施对番茄生育和磷素利用率的影响

【目的】碱性土壤降低植物对磷的吸收和利用,黄腐酸能活化土壤中的固定态磷。利用黄腐酸克服碱性土壤对磷的固定效应,提高磷肥利用率,为磷肥减施增效提供新途径。【方法】采用盆栽方式,以番茄(Solanum lycopersicum L.)‘罗拉’为供试品种,在土壤pH为6.5和8.0两种条件下,设置4个施磷(P₂O₅)水平(0、0.1325、0.265和0.53 g·kg^-1,分别标记为0%P、25%P、50%P和100%P);在此基础上,设不添加和添加0.08 g·kg^-1黄腐酸两种组合(分别标记为-FA和+FA),共计16个处理。研究黄腐酸与磷肥施用在中、碱性土壤条件下对番茄植株生长、产量、品质和磷素利用的影响。【结果】碱性土壤抑制番茄植株生长,降低产量、各组织磷含量和植株磷吸收量,但对番茄果实品质的形成具有促进作用。磷肥减施造成番茄生长、产量和品质下降,降低植物各组织磷含量、植株磷吸收量和肥料产量贡献率,但对磷肥利用率有一定的提升作用。本研究的任一种土壤条件和磷水平下,施用黄腐酸均可提高番茄对磷的吸收...     

沼液对番茄产量及其植株生理活性指标的影响

以番茄L402为供试作物，以等氮、等磷、等钾为前提条件。采用沼液，化肥，化肥 沼液混施3种施肥类型做对比试验，辅以根外追施沼液，研究施肥量，施肥种类及叶面喷施沼液浓度的不同水平组合对番茄植株生理活性指标及其产量的影响。结果表明；施用沼液或化肥 沼液混合肥料，辅以植株液面喷施沼液，对提高番茄植株生理活性及其产量有明显的作用。番茄植株多酚氧化酶及抗坏血酸氧化酶活性比对照分别提高114.7%和206.4%。叶绿素含量比对照提高11%，番茄产量比对照提高51.7%。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

番茄RBX1基因的功能初探

E3泛素连接酶是泛素蛋白酶体途径中非常重要的蛋白复合体,而大部分的E3连接酶都以Cullin蛋白作为支架,所有基于Cullin蛋白的 E3 连接酶都含有一个催化亚基RBX1。RBX1对于E3复合体结合E2和Cullin蛋白的活化具有重要作用。利用酵母双杂交技术鉴定出番茄RBX1蛋白与番茄CUL4蛋白有直接的相互作用。通过荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析野生型番茄中RBX1基因的组织特异性,结果显示RBX1基因在番茄各组织中均有表达,但在花与果实中表达量较高,茎和叶中相对较少。同时构建植物过量表达载体 PBI121-35S-RBX1并转化番茄,获得 3 株过量表达和 3 株RBX1共抑制转基因植株。研究发现共抑制的转基因植株表现出叶片变大、顶端优势变弱和不育等表型,说明RBX1基因在番茄的生长发育中发挥重要作用,推测植物RBX1基因可能与生长素和油菜素内酯等植物激素应答以及细胞增殖有关,为进一步研究该基因在植物中的生物学功能提供了线索。