基于DPO引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶伴随病毒3号

正葡萄卷叶病是葡萄上一种重要的病毒病,在国内分布较为普遍,引起该病的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)是由多种病毒单独或复合侵染造成。已报道的GLRaVs至少有5种,其中GLRaV-3是葡萄卷叶病毒属Ampleovirus典型成员(Ling et al.,2004)。目前,检测GLRaV-3的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法、     

葡萄卷叶伴随病毒2实时荧光定量RT-PCR技术的检测应用

通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10^-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。     

4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测

 葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。     

葡萄卷叶病毒RT-PCR检测技术

为调查葡萄植株携带葡萄卷叶病毒(GLRaV)的情况，以带毒和非带毒指示植物“品丽珠”为试验材料提取总RNA，并以此总RNA为模板进行RT—PCR扩增，建立了GLRaV的RT—PCR检测体系，并对GLRaV cDNA序列进行测定，结果成功地检测到了GLRaV。经多次试验证明，该检测结果准确可靠，可以用于GLRaV的检测。     

SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBRGreenI实时定量RT—PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune Dwarf vi—rus,PDV）、樱桃病毒A（CherryvirusA,CVA）、樱桃小果病毒一2（Little cherry virus一2,LChV－2）的甜樱桃“红灯”PrunusaviumCV．RedLamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA—CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2一卯表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2一cP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测

研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

葡萄卷叶伴随病毒1号和3号宁夏分离物部分基因序列分析

为明确葡萄卷叶伴随病毒(GLRaVs)在宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄上的侵染状况,采用RT-PCR技术对40份酿酒葡萄样品中的GLRaV-1~GLRaV-5进行了外壳蛋白(CP)、复制酶(RdRp)和热激蛋白(HSP70)基因序列的克隆和分析。检测结果表明,在所检测的5种病毒中,除GLRaV-2和GLRaV-4未检测到外,GLRaV-1和GLRaV-3的检出率最高,分别为20.0%和32.5%,GLRaV-5的检出率仅为5.0%;有6个样品存在GLRaV-1和GLRaV-3两种病毒复合侵染。序列分析表明,GLRaV-1宁夏分离物的部分CP基因序列长度为232nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为90%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的CP基因序列长度为942nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为40%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为40%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的RdRp基因序列长度为683nt,其各分离物间的核苷酸序列同源率为90%以上,与已报道的国内外其他分离物RdRp基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的HSP70基因序列长度为546nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为96%,与已报道的国内外其他分离物HSP70基因序列相比,其同源率为96%~99%。     

葡萄卷叶相关病毒13在我国葡萄上的首次报道

<正>我国葡萄品种资源丰富,栽培面积逐年增加。葡萄感染病毒后,便终生带毒,持续危害,造成生长发育迟缓,树势衰退,严重影响葡萄的产量和品质。山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)是我国重要的野生果树资源,其抗病能力较强,是培育抗病、抗寒优良品种的珍贵种质。山葡萄浆果营养物质丰富,是酿     

应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

 本研究建立了葡萄病毒B的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10^-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43% ~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5% ~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31% 和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明, RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。     

应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

 本研究建立了葡萄病毒B的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10^-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43% ~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5% ~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31% 和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明, RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。     

酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。     

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒

 利用改进的CTAB法提取出优质的草莓总RNA,可以稳定地进行RT PCR。针对草莓斑驳病毒(SMoV)基因组序列设计筛选引物,对病毒基因组的不同区域进行扩增,扩增产物经克隆、测序证明为SMoV的特异片段,与国外序列的同源性为91%~97%。为了监测RNA的质量和RT PCR反应的正常进行,在检测体系中引入线粒体NADH脱氢酶基因ND2亚基作为内标,内标引物跨越内含子区域,只对剪接后的mRNA进行特异扩增,可以较好地监测整个检测过程。在国内首次建立了SMoV的RT PCR检测体系,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,对草莓病毒指示植物和草莓栽培品种都可以进行快速稳定的检测。     

棉铃虫幼虫取食转HaHR3基因烟草后中肠组织的病理变化

<正>通过植物介导的RNAi能够沉默棉铃虫蜕皮调节转录因子Ha HR3基因。棉铃虫取食含有dsRNAs的转基因烟草后,其Ha HR3基因的转录水平及蛋白表达水平均被有效抑制,导致棉铃虫幼虫生长发育畸形或死亡(尹富仕等,2010;Xiong et al.,2013)。本研究利用透射电镜观察棉铃虫取食转Ha HR3基     

地被菊CVB病毒基因的RT-PCR检测

为建立可靠、灵敏且高效的地被菊中菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)的检测方法,利用特异性CVB基因引物,通过RT-PCR技术进行了特异性、重复性和灵敏度测试,最终利用优化的RT-PCR体系对地被菊植株感染CVB病毒情况进行了检测。结果显示,以染病地被菊植株的总RNA为模板扩增出的特异性片段编码211个氨基酸,与基因数据库中其它来源的CVB基因外壳蛋白同源性为96%~99%,可确定为菊花B病毒外壳蛋白基因;重复性和灵敏度检测中均获得了清晰的目标条带,且1 ng的总RNA即可扩增出特异性片段;对7个地被菊品种共32个植株的检测中,CVB的检出率为56.2%,检测的准确率为68.75%。表明建立的地被菊CVB基因的RT-PCR检测体系可有效用于地被菊植株感染病毒情况的鉴定。     

基于多拷贝基因的葡萄皮尔斯病菌PCR检测方法

正葡萄皮尔斯病是由木质部限制性γ变形菌纲细菌Xylella fastidiosa subsp.fastidiosa(Xff)引起的一种葡萄上的毁灭性病害,可通过葡萄繁殖材料和玻璃翅叶蝉Homalodisca coagulata等昆虫媒介进行传播。该病主要在美洲的美国、墨西哥、阿根廷、秘鲁等国家发生流行(Davis et al.,1978)。最近,Su et al.(2013)证实该病在台湾发生,这是在亚洲地区的首次报道。目前国外对Xff的分子检测主要是基于单拷贝基因的常规PCR和实时荧光定量PCR方法     

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。