寡糖诱导向日葵抗锈病的信号转导途径

为了解寡糖诱导向日葵抗锈病过程中的信号转导途径,利用寡糖、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）预先喷雾处理向日葵叶片,1d后接种锈菌,通过对植株体内脂氧合酶（LOX）活性及SA含量的测定,并通过RT-PCR对SA、JA信号途径的标记基因PR5和PDF1.2等表达水平进行测定,初步确定诱导抗性表达的信号转导途径。结果表明：经寡糖诱导后,向日葵叶片内LOX活性降低,SA含量上升,且诱导水杨酸途径标记基因PR5表达量增加。结果说明寡糖诱导向日葵抵抗锈病主要与SA介导的信号途径有关。     

甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。     

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中，JA（茉莉酸）合成相关基因表达量升高，但是JA信号传递却受到了抑制，推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白，使其活性降低，从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列，为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理，本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测，构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库，并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选，获得了5个来自油菜的互作蛋白：丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物（BnCOP9）、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶（BnDcoH）、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白（BnTSJT1）;2个来自核盘菌的互作蛋白：MFS结构域蛋白（SsMFS）和Rho3 GTP酶（SsRho3）。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用，挖掘致病或抗病相关基因，进一步解析其机理奠定了基础。     

对瓜类疫霉菌诱导响应的黄瓜WRKY转录因子筛选研究

以黄瓜感病品种‘B80’为材料并通过RT-qPCR技术,针对黄瓜全基因组54个CsWRKYs基因,在瓜类疫霉菌侵染后对其进行表达分析,并在水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理下对受瓜类疫霉菌诱导（或抑制）基因进行表达检测,分析其可能参与的抗病相关信号通路。研究结果表明：15个CsWRKYs基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56）受瓜类疫霉菌诱导上调表达,仅CsWRKY6受瓜类疫霉菌抑制下调表达。在SA和MeJA处理下,7个CsWRKYs基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）受SA诱导,CsWRKY44同时受SA和MeJA诱导,CsWRKY6受MeJA抑制下调表达,推测 7个基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）可能通过SA介导的信号通路调控植物对病原菌的响应;CsWRKY6可能通过JA介导的信号通路调控植物防御反应过程;CsWRKY44则可能同时参与SA和JA介导的抗病相关信号通路。     

向日葵查尔酮合酶HaCHS基因的克隆与逆境应答

为探讨查尔酮合成酶(CHS)基因在向日葵抗逆机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上,从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个CHS的c DNA序列,该基因开放阅读框为1 197bp,编码398个氨基酸残基,分子量为43.54k D,等电点为6.17,命名为Ha CHS(Gen Bank登录号为KR921882)。氨基酸序列分析显示,Ha CHS具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(C~(167),H~(306)和N~(339))和特征多肽标签序列GVLFGFGPGL。系统进化分析表明,Ha CHS与菊科植物的大丽菊、紫茎泽兰和黑心菊等的CHS蛋白有很高的同源性,氨基酸序列相似性在93%~94%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在向日葵花中表达量最高为19.96,其次是盘、叶、茎和种,在根中的表达量最低为0.02。Ha CHS基因表达受核盘菌、创伤、4℃低温和茉莉酸(JA)等因素调控,但对脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)处理的应答差异不显著。     

甘蓝型油菜MAP激酶4的序列及其诱导表达分析

拟南芥MPK4（AtMPK4）在病害抗性中具有重要作用。本文克隆和分析了油菜MPK4（BnMPK4）的cDNA及其氨基酸序列和诱导表达变化。推导的氨基酸序列含有T201E202Y203磷酸化位点和CD锚定区域,与AtMPK4的序列相似性为95%。用化学物质苯丙噻重氮、甲基茉莉酸、草酸以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnMPK4在各诱导或处理后的表达量。结果表明,苯丙噻重氮快速诱导该基因的表达,甲基茉莉酸抑制其表达;草酸和核盘菌均快速诱导该基因上调表达,并且二者的上调表达趋势相似。结果表明油菜MPK4可能在油菜菌核病防卫反应中起作用。     

MeJA和ET对巴西橡胶树胶乳HbGSK1基因表达的影响

GSK3蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。GSK3是否在橡胶树JA和ET信号途径起作用尚不清楚。qPCR分析结果表明，机械伤害、MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树JA和ET植物激素信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达的调节具有协同作用。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

拟南芥AtTrx5增强植物菌核病的抗性研究

核盘菌是危害十字花科作物生产的重要病原菌。核盘菌诱导寄主产生过量活性氧（ROS），造成寄主细胞死亡，硫氧还蛋白（Trx）在寄主抗氧化过程中起重要作用。筛选并鉴定硫氧还蛋白（Trx），分析其与核盘菌抗性的关系，将为植物抗菌核病育种提供基因资源。本研究通过生物信息学及转录组数据分析，从拟南芥中筛选到一个关键Trx基因AtTrx5。AtTrx5与甘蓝型油菜BnaA08g04320D的亲缘关系最近，氨基酸相似性为85%。油菜同源基因Trx5表现出上调表达。AtTrx5超表达植株在接种核盘菌24 h后的菌斑面积相比野生型（WT）减小30%～39%，而AtTrx5基因T-DNA突变体的菌斑面积比WT增加39.2%。在侵染过程中超表达转基因拟南芥中AtTrx5的表达量均高于WT，而T-DNA突变体中AtTrx5的表达量则低于WT。DAB染色、H2O2含量、·O2-含量测定结果表明，侵染过程中拟南芥T-DNA突变体中积累的ROS高于WT，超表达转基因拟南芥中积累的ROS少于WT。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

Bph36介导的抗性机制及相关信号通路的研究

褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål., BPH）是水稻最主要的害虫之一,给水稻生产造成严重的危害。携带不同抗性基因的抗褐飞虱水稻材料抗性机制不同,挖掘普通野生稻抗褐飞虱基因并研究其介导的抗性机制及相关信号通路对水稻育种具有重要的意义。本研究基于课题组前期从广西普通野生稻‘W2183'挖掘出的位于4号染色体InDel标记S13和X48之间38 kb处新基因Bph36,以‘9311'和‘抗蚊青占'为感性对照,05RBPH16和NIL-Bph36为抗性对照,通过褐飞虱宿主选择性、蜜露量测定、褐飞虱存活率及褐飞虱生长速率等方法分析Bph36介导的抗褐飞虱机制;同时,以‘抗蚊青占'为感性对照,NIL-Bph36为抗性对照,通过qRT-PCR分析植物防御昆虫侵害的三大信号途径：水杨酸、茉莉酸和乙烯相关基因表达量的差异。抗性机制研究结果表明：褐飞虱在抗性材料植株上的虫口密度显著低于感性材料植株,抗性材料上的褐飞虱存活率、群体生长率及取食后排泄的蜜露量均比感性对照显著降低。Bph36介导的抗性机制是寄主抗生性和害虫趋避性相互作用的结果。qRT-PCR结果表明：褐飞虱取食后,各个时间段抗性材料NIL-Bph36植株中水杨酸合成相关基因EDS1、PAD4、PAL和水杨酸途径病程相关蛋白基因PR10的表达量显著高于感性材料‘抗蚊青占'植株中的表达量;抗性材料NIL-Bph36植株中,茉莉酸合成基因LOX2和茉莉酸积累基因AOS2的表达量比褐飞虱取食前显著提升,但是比同时段感性材料植株中表达量显著降低;褐飞虱取食后,抗、感性材料植株中乙烯信号途径基因EIN2的表达量都受到抑制,基因ACO3表达量都提高,但2种材料间的差异不显著。茉莉酸途径和乙烯途径参与了NIL-Bph36植株抗褐飞虱的基础防御反应,但Bph36激活的抗性不是茉莉酸和乙烯依赖的信号防御途径而是激活水杨酸依赖的系统获得性抗性。研究结果为进一步研究Bph36与其他抗性基因聚合,培育兼有多种抗性机制和防御信号途径的优良品种奠定基础。     

水稻富含半胱氨酸类受体激酶家族基因对纹枯病菌和植物激素的响应特征分析

[目的]明确水稻富含半胱氨酸类受体激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases,CRK)家族基因对纹枯病菌侵染和植物激素的响应特征,是解析CRK在水稻纹枯病抗性中的功能的重要前期工作.[方法]利用生物信息学方法构建了水稻45个CRK的系统发育树,并利用qPCR分析了它们对纹枯病菌和对植物...     

茶尺蠖为害提高邻近茶苗对茶尺蠖幼虫的防御能力

本文研究了茶树虫害诱导挥发物(Herbivore-induced plant volatiles,HIPVs)对邻近茶苗防御能力的影响。将健康茶苗放在茶尺蠖取食的茶苗附近,作为HIPVs的处理,测定了茶树防御相关基因在不同处理下的表达水平、抗性防御物质的水平,并检测了茶尺蠖危害茶苗邻近植株对茶尺蠖幼虫生长的影响。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害茶苗释放的HIPVs在处理后24 h和12 h内分别显著诱导邻近茶苗Csi LOX1和Csi ACS1基因的表达水平,这些挥发物还能增强茶尺蠖取食诱导的防御基因的表达。HIPVs处理3 d后,茶树的重要防御物质多酚氧化酶(Polyphenol oxidases,PPOs)活性显著高于对照,是对照的1.36倍,同时,取食这些茶苗的茶尺蠖幼虫体重也显著低于对照。上述结论表明茶尺蠖取食诱导的挥发物能够作为信号物质在茶树中传递,并能够通过增强茉莉酸和乙烯抗虫途径提高对茶尺蠖的抗性。     

芸薹根肿菌侵染早期甘蓝型油菜转录组分析

根肿病是油菜最为严重的病害之一。为探索根肿病菌和油菜互作中的抗性分子机制,采用RNA-seq技术对根肿病早期侵染中抗病品系ZHE-226(R)和感病油菜10159(S)进行转录组分析。与感病材料S相比,在0、12、48和72h 4个接种时间点,抗性材料R中共有809个基因上调表达,1082个基因下调表达。模式识别受体、几丁质酶、R基因、WRKY、水杨酸和茉莉酸等抗性相关(PRR)基因在抗病材料R和感病材料S中诱导表达并表现出不同的表达模式。抗病材料R中PRR相关基因主要表现为下调表达,R基因上调表达,水杨酸表现为前期下调后期上调表达,茉莉酸、几丁质酶和WRKY因子在R和S中均诱导表达。结果表明PRR介导的PTI(病原相关分子模式触发的免疫反应)在感病材料S中显著诱导,在抗病材料R中作用不明显;R基因介导的ETI(效应蛋白触发的免疫反应)和水杨酸介导的抗病信号途径对根肿病抗性起重要作用。     

外源水杨酸诱导的部分甜瓜自毒作用相关基因的表达分析

以甜瓜(Cucumis melo)品种‘新银辉’为材料,采取根灌法,以水杨酸(10μmol/L)处理甜瓜幼苗,通过Real-Time PCR对叶片中部分自毒作用相关基因的表达量进行定量分析,以探究外源水杨酸诱导对甜瓜自毒作用的影响。结果显示,经外源水杨酸诱导后:(1)在催化苯丙烷类代谢途径的3个初始反应的蛋白酶编码基因中,PAL和C4H随处理后时间增加,呈逐渐上调趋势,但PAL比C4H更快响应胁迫,而4CL转录水平没有显著变化;(2)在类黄酮生物合成的3个关键酶的基因中,CHI、F3H均显示出不同程度的下调,CHS于处理后1 d略微上调,然后恢复至处理前水平;(3)两个转录因子基因WD40、R2R3-MYB分别在不同处理时间后显著下调;(4)WD40与CHI的表达相关性较高。据上述结果 ,水杨酸诱导后:(Ⅰ)CHI表达可能与转录因子WD40蛋白相关;(Ⅱ)WD40、R2R3-MYB与PAL、C4H、4CL、CHS间不存在简单、明确的调控关系;(Ⅲ)柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质合成减少。     

白背飞虱取食后水稻幼苗内源激素变化研究

[目的]研究白背飞虱取食后苗期水稻内源激素含量变化规律及其合成途经相关基因的差异表达,为进一步解析内源激素调控水稻白背飞虱抗性机理提供参考.[方法]利用UPLC-MS方法测定了白背飞虱敏感材料9311与抗性近等基因系(NIL)在白背飞虱取食0、24和48 h后植株水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和生长素...     

向日葵菌核病田间接种方法及品种抗病性研究

为建立有效的向日葵菌核病田间接种鉴定方法,本研究以菌核病菌菌丝体悬浮液和高粱粒菌丝体作为接种物,分别对不同抗感向日葵品种在始花期和盛花期进行人工接种,从而筛选出最佳接菌物类型、浓度及接种时期,并用此方法对52个品种进行抗性评价。试验结果表明：两种接种物均可使向日葵感病品种产生盘腐症状。用菌丝体悬浮液接种时,7.5~15.0 g/L浓度即可区分出向日葵品种间抗感性差异。始花期接种较盛花期可获得更高的发病率及病情指数。同时筛选出5个对盘腐型菌核病表现抗病的向日葵品种。本研究所建立的田间接种方法能够有效地对向日葵进行抗菌核病筛选和鉴定,可用于向日葵抗菌核病育种。      

油菜与核盘菌互作分子机理研究进展

菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary）引起的真菌性病害,每年导致油菜（Brassica napus L.）产量损失10%-20%,是制约我国油菜生产最主要的病害。培育抗（耐）病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。本文主要综述了近五年油菜-核盘菌互作分子机制的研究进展。研究表明：（1）核盘菌侵染寄主早期存在活体营养型阶段;（2）草酸提供的酸性pH,而非草酸本身,是核盘菌的必需致病因子;（3）核盘菌有效地利用效应蛋白抑制寄主的抗病反应或者诱导寄主细胞坏死以帮助其侵染;（4）油菜对菌核病的抗性具有中等遗传力,为数量抗性;（5）病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）引发的免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）是油菜对核盘菌产生数量抗性的主要根源;（6）功能基因组学研究表明抗（耐）病油菜材料防卫反应更加剧烈,能有效调控细胞内的氧化还原平衡状态,及时清除过量活性氧（reactive oxygen species,ROS）的积累,抑制细胞死亡。核盘菌-油菜互作分子机制的研究将有助于指导油菜抗菌核病育种。