甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究

甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测利玛原甲藻的研究

建立应用SYBR Green实时荧光定量PCR技术快速定量检测利玛原甲藻的方法。结果表明,理论上,该方法对于4个利玛原甲藻细胞便可检测出,灵敏度较高;实际应用时检测出的细胞数为(505±14.72)cells/L(镜检为600 cells/L,误差为15.83%,符合海洋调查规范中浮游生物调查误差在20%以内的要求)。本检测方法具有快速、特异、准确等优点,可作为海洋环境监测中定性定量检测利玛原甲藻的方法。     

甘蔗黄叶病毒基因型研究进展

综述了世界甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)基因型的研究进展,研究表明,ScYLV为正单链RNA病毒,全基因组由5895～5899个核苷酸组成。目前基于ScYLV基因组核苷酸序列的对比可将ScYLV划分为7种基因型,其中BRA基因型为主要基因型。不同基因型的ScYLV存在致病性差异。     

抗原直接包被间接ELISA检测甘蔗黄叶病毒

利用正交设计L9(34)方法优化甘蔗黄叶病毒(SCYLV)抗原直接包被间接ELISA实验条件,统计结果表明,甘蔗蔗汁和蔗叶SCYLV粗提液包被抗原合适体积为150μL,最佳的抗体浓度SCYLV-IgG多克隆抗体(一抗)稀释1500倍,碱性磷酸酶羊抗兔IgG(二抗)稀释20000～30000倍,最佳反应时间为1～2h。应用这一优化体系,分析甘蔗不同部位的蔗茎和不同叶位的叶片SCYLV滴度的差异,结果表明,上部甘蔗蔗茎SCYLV病毒含量显著高于中下部蔗茎组织,最高可见肥厚带叶(+1叶)及其上一叶(-1叶)的嫩叶组织SCYLV病毒含量显著高于最高可见肥厚带叶以下第2叶(+3叶)和第4叶(+5叶)的老叶组织。甘蔗幼嫩组织部位SCYLV滴度较高,更适合于病毒检测。     

槟榔隐症病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、精准且能定量分析槟榔隐症病毒1型（Areca palm velarivirus 1, APV1）的检测方法。本研究参照GenBank中已登录的APV1全基因组序列,在p21蛋白基因保守区域和p60蛋白基因保守区域之间设计1对特异性RT-PCR引物,并构建阳性重组质粒;在p60蛋白基因保守区域部分设计荧光定量PCR特异性引物和TaqMan-MGB探针,利用阳性重组质粒,构建标准曲线,并对该检测方法的敏感性、特异性、稳定性及其应用效果进行验证。结果显示：该方法对阳性质粒标准品检测的敏感性达3.0×10¹ copies/μL级别,是常规RT-PCR敏感性的100倍;标准曲线显示,C_t值与拷贝数的对数呈线性关系,其标准曲线方程为y=-3.2748x+42.957,扩增效率为102%,相关系数R²为0.9992;该方法对APV1的检测具有较好的特异性,其他槟榔病原物及内生菌不会对本方法产生非特异性干扰;批内与批间重复性试验结果显示,该方法对APV1的检测具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对海南万宁、琼海、定安、文昌等4个市（县）采集的181份疑似样品进行检测,阳性率分别为91.95%、86.95%、89.65%、73.68%,其阳性的病毒拷贝数最高达1.59×10⁷copies/μL,表明海南部分地区APV1病毒载量较高、流行情况比较严重。     

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)叶鞘(2.50×108 copies/mg)假茎(1.29×108 copies/mg)球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。     

实时定量荧光PCR法检测马铃薯黑胫病菌

马铃薯黑胫病是国内外马铃薯产区发生比较普遍的一种细菌性病害,严重地影响了马铃薯的产量和质量。本研究根据Potato Black Leg序列,设计出马铃薯黑胫病菌特异性的引物,对10种供试菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,该方法的特异性好,可以将马铃薯黑胫病菌和其它马铃薯常见病害相区分;灵敏度较高,可检测出最低的黑胫病菌浓度为3.6~3.9 cfu.mL-1;而且检测时间仅用4 h,大大缩短了检测周期。该方法可有效地应用于马铃薯黑胫病菌的检测和监控。     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究

以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。     

一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

针对小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)在症状、传播途径、发生规律等方面高度相似、难以用常规手段鉴定的问题,根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物CWWY-R2、CW1-F2和WY1-F2,以植物总RNA为模板、CWWY-R2为引物反转录合成cDNA.通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系:cDNA1.6 μL,引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,10×PCR Buffer(不合Mg2+)2μL,dNTPs(10 mmol·L-1 each)0.4 μL,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.8μL,MgCl2(25 mmol·L-1)0.8μL,ddH2O 13.2 μL,合计20 μL; PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94℃ 50 s,50℃50 s,72℃90 s,共30个循环,72℃延伸10 min.WYMV和CWMV的PCR扩增预期目的片段分别为508和918 bp.利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测,它们分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染,证明该方法准确性较高,可用于两种病害同步检测.     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

桂北果蔗甘蔗杆状病毒的分子检测与分析

从桂北主栽果蔗区采集表现褪绿斑点或花叶及无症状的未脱毒拔地拉、青皮果蔗、紫皮果蔗、罗汉果蔗、广东黄皮、同安果蔗及脱毒拔地拉等7个品种蔗叶样品88份,用SCBV检测引物对采集的样品进行PCR检测分析。检测结果显示:有2份为SCBV阳性,检出率2.3%,均为未脱毒果蔗拔地拉,其中1份叶片无明显的症状;脱毒拔地拉、青皮果蔗、紫皮果蔗、罗汉果蔗、广东黄皮、同安果蔗检测均为阴性。表明桂北果蔗区存在SCBV侵染。     

我国木薯花叶病毒病的发生危害及其病原鉴定

为明确国内木薯花叶病毒病(cassava mosaic virus disease)的危害情况、田间症状及其病原类型,本研究于2018—2019年调查了该病在国内的分布情况、症状特征及种质来源等数据,采集了8省(区)19地的384份样品,利用特异性引物检测2种木薯花叶病毒侵染引起的症状类型,并通过序列比对明确其病原特点...     

A Single-Tube,Functional Marker-Based Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Major Bacterial Blight Resistance Genes Xa21,xa13 and xa5 in Rice

In marker-assisted breeding for bacterial blight(BB) resistance in rice, three major resistance genes, viz., Xa21, xa13 and xa5, are routinely deployed either singly or in combinations. As efficient and functional markers are yet to be developed for xa13 and xa5, we have developed simple PCR-based functional markers for both the genes. For xa13, we designed a functional PCR-based marker, xa13-prom targeting the In Del polymorphism in the promoter of candidate gene Os8N3 located on chromosome 8 of rice. With respect to xa5, a multiplex-PCR based functional marker system, named xa5 FM, consisting of two sets of primer pairs targeting the 2-bp functional nucleotide polymorphism in the exon II of the gene TFIIA5(candidate for xa5), has been developed. Both xa13-prom and xa5 FM can differentiate the resistant and susceptible alleles for xa13 and xa5, respectively, in a co-dominant fashion. Using these two functional markers along with the already reported functional PCR-based marker for Xa21(p TA248), we designed a single-tube multiplex PCR based assay for simultaneous detection of all the three major resistance genes and demonstrated the utility of the multiplex marker system in a segregating population.     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

水稻GA20ox-2基因mRNA的TaqMan荧光定量RT-PCR检测

 成功建立了一项基于TaqMan 实时荧光定量的RT-PCR技术,定量分析水稻半矮化关键基因之一GA20ox-2转录水平。该技术体系中重组质粒标准品的制备方法具有很好的实用性;质粒标准品对基因GA20ox-2表达的实时定量准确、可靠、便捷。标准曲线表明,所建立的GA20ox-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达102～107拷贝;扩增效率高（E=100.3%）;稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数仅分别为0.12%～0.31%和0.21%～0.34%;循环阈值与PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（^r＝0.999）,可对GA20ox 2基因表达进行准确实时定量。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。