广西猪流感病毒H1N2亚型的血清学调查

【目的】了解广西猪群中猪流感（SI）的流行情况,为科学防控广西SI提供参考依据。【方法】以猪流感病毒（SIV）H1N2亚型毒株为抗原,采用微量血凝抑制试验（HI）方法,对2009年7月~2011年3月在广西12个市采集的997份猪血清进行SIV的血清学调查。【结果】2009年的H1N2亚型抗体阳性率为33.4%,比2010年和2011年1～3月的高;广西各市的H1N2亚型抗体阳性率为0~83.1%,其中河池和百色两市的H1N2亚型抗体阳性率较高,分别为83.1%和51.1%,崇左市为零,其他市的H1N2亚型抗体阳性为4.0%~32.1%。【结论】广西地区猪群在2009～2011年均受到猪源H1N2亚型不同程度的感染。     

广西猪流感病毒H1N2亚型的血清学调查

【目的】了解广西猪群中猪流感（SI）的流行情况,为科学防控广西SI提供参考依据。【方法】以猪流感病毒（SIV）HIN2亚型毒株为抗原,采用微量血凝抑制试验（HI）方法,对2009年7月～2011年3月在广西12个市采集的997份猪血清进行SIV的血清学调查。【结果】2009年的H1N2亚型抗体阳性率为33．4％,比2010年和2011年1-3月的高;广西各市的H1N2亚型抗体阳性率为0—83．1％,其中河池和百色两市的H1N2亚型抗体阳性率较高,分别为83．1％和51．1％,崇左市为零,其他市的H1N2亚型抗体阳性为4．0％～32．1％。【结论】广西地区猪群在2009～2011年均受到猪源H1N2亚型不同程度的感染。     

一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

为了给猪流感疫苗的研制做准备,试验将从某猪场现地采集疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品,经过处理后接种至10～11日龄SPF鸡胚进行盲传,分离到1株具有血凝性的病毒.通过血清学、分子生物学鉴定、电镜观察、动物回归试验等方法对该病毒进行鉴定.结果发现:该病毒可与猪流感病毒H3亚型阳性血清特异性结合;通过分子生物学检测,该分离株...     

H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％．     

猪流感病毒H1N2亚型油乳剂灭活苗的免疫效果

【目的】评估以H1N2亚型猪流感病毒（SIV）制成油乳剂灭活苗的免疫效果,为预防SIV的发生和蔓延提供参考依据。【方法】采用不同剂量的SIV H1H2亚型油乳剂灭活苗对猪只进行免疫,免疫后采血,用HI试验测定抗体效价,连续测定至第10周,然后对猪只进行攻毒,并观察其临床症状及进行病毒检测等。【结果】中免疫剂量组（4 mL/头）和高免疫剂量组（6 mL/头）的抗体滴度高于低免疫剂量组（2 mL/头）;免疫组与对照组在攻毒后猪只的体温无显著差异（P >0.05）,免疫组攻毒后无明显的临床症状,除中免疫剂量组在攻毒后第1 d检测出鼻粘液病毒外,其他时间及其他剂量组均未检测到SIV,对猪只起到良好的保护作用。【结论】SIV H1N2亚型油乳剂灭活苗具有良好的免疫效果,对同亚型病毒的攻击具有一定保护作用,其最佳免疫剂量为4 mL/头。     

H9N2亚型猪流感病毒的分离、鉴定及其对小鼠的致病性研究

[目的]确定分离的H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性。[方法]利用此株猪流感病毒对SPF级6～8周龄、雌性BALB/c小鼠进行滴鼻感染,观察小鼠临床症状,感染后第2、6和14天分别剖杀小鼠,摘取各主要脏器后对其进行病理学检查。[结果]感染小鼠出现精神不振、体重下降、引起以弥漫性肺泡损伤为主的临床症状和病理变化。[结论]该研究成功进行了H9N2猪流感病毒对BALB/c小鼠的感染,可以作为感染模型进行H9N2猪流感病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。     

广西猪流感血清学调查

采用血凝抑制试验对广西7个市30个猪场的2156份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3亚型抗体的检测。结果显示,在被调查的30个猪场中,H1亚型抗体阳性率为96.67%,H3亚型抗体阳性率为86.67%,H1 H3亚型抗体阳性率为86.67%;在检测的2156份血清样品中,H1亚型抗体阳性率为29.04%,H3亚型抗体阳性率为31.54%,H1 H3亚型抗体阳性率为12.15%。表明在所调查的广西猪场中,猪流感病毒的感染较为普遍,大部分猪场都曾被H1、H3亚型感染。     

不同佐剂H3N2亚型猪流感灭活疫苗的免疫效果比较

选用福建分离猪流感A/Swine/Fujian/F1/03(H3N2)毒株为制苗种毒,制成2种不同佐剂灭活疫苗。挑选H3N2亚型猪流感抗体阴性的母猪和断奶仔猪用于检测比较2种灭活疫苗的免疫效果。结果表明:IMS1315佐剂灭活疫苗首免母猪和断奶仔猪7d后均可检测到HI抗体,二免28d后抗体水平最高,其中母猪的抗体均值为11.0Log2,断奶仔猪的抗体均值为10.2Log2,二免150d后仍维持在较高抗体水平,均值在6.5Log2以上;医用白油佐剂灭活疫苗首免母猪和断奶仔猪14d后均可检测到HI抗体,二免28d后抗体水平达最高,其中母猪的抗体均值为10.2Log2,断奶仔猪的抗体均值为10.0Log2,二免150d后抗体水平均值在6.0Log2以上。表明2种不同佐剂灭活疫苗不论免疫母猪还是仔猪,均具有较长的抗体消长期,但IMS1315佐剂灭活疫苗产生抗体略好于医用白油佐剂灭活疫苗。     

H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1﹕64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1﹕1 024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1﹕32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1﹕512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

H9N2亚型猪流感病毒的增殖及毒力测定

目的将H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)进行增殖并测定其毒力。方法采用鸡胚尿囊腔增殖法,将病毒接种于10日龄SPF鸡胚进行增殖,血凝(HA)试验测定病毒液效价,Reed-Muench法测定病毒的鸡胚半数感染量(EID50)和小鼠半数致死量(MLD50)。结果经过增殖后,H9N2-SIV血凝效价为1∶256,EID50=10-6.5·0.1mL-1,MLD50=10-2.32·0.l mL-1。结论 H9N2-SIV可以作为进一步试验用病毒。     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

[目的]了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础.[方法]运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05( H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析.[结果]扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151 bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717 aa.经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%~ 100.0%和98.5%~99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近.[结论]广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题.     

猪对禽用禽流感H5N1基因重组灭活疫苗免疫应答

为评估猪对禽流感疫苗的敏感性、安全性和免疫效果,将63日龄育肥肉猪分为4组,按不同剂量进行禽流感H5N1亚型疫苗的免疫试验,其中第1、3组于首免后第21天按同样剂量进行二免。结果表明:试验猪首免后第10天能检出特异性禽流感抗体,随后抗体转阳率和抗体效价持续上升。二免试验组免疫反应优于一免试验组,而以第1组免疫效果最好。同时,采用荧光RT-PCR技术对试验猪的鼻拭样品进行H5亚型禽流感病毒的检测,结果均为阴性,表明目前使用的禽流感H5N1疫苗不会造成猪体带毒,使用安全。     

繁殖障碍型H3亚型猪流感病毒的分离与鉴定

于广东惠州市某猪场采集流产死胎的肺组织、胎衣及鼻棉拭子,病料处理后经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种获得1株有血凝(HA)活性的病毒,通过AGP试验初步确定为猪流感流感病毒;但此病毒的血凝现象不能被抗H1亚型猪流感单因子血清、抗H5亚型猪流感单因子血清、抗H7亚型猪流感单因子血清、抗H9亚型猪流感单因子血清抑制,而能被抗H3亚型猪流感单因子血清抑制;通过H3亚型猪流感病毒RT-PCR分子生物学诊断,最终确定该病毒为H3亚型猪流感病毒.动物回归试验结果显示,攻毒小鼠出现精神萎靡、厌食、嗜睡、被毛松乱、呼吸较急促,攻毒后7 d采集小鼠血清进行检测,HI效价为3log2～4log2;剖检发现病毒性肺炎,且能从病料中再次分离到H3亚型猪流感病毒.     

一株H3N2犬源猫流感病毒NP 基因的遗传变异性分析

从被感染猫体内分离出流感病毒,利用RT-PCR扩增NP基因,分析其遗传变异性.与NCBI上的14株流感病毒的NP全基因序列进行比对分析,发现其与参考毒株的NP基因序列的相似性为79.3％～99.7％,其中与感染株A/canine/Guangdong/1/2007(H3N2)的NP基因序列的相似性最高,为99.7％.基因序列比对发现,编码区存在5处突变:A33G、A81G、C235T、G345A、A567G;氨基酸仅存在1处变异:I189M.研究结果表明,犬流感病毒在犬和猫之间存在跨中间传播,虽然变异系数不高,但是567位碱基突变所造成的氨基酸突变为NP基因的遗传性和种间特异性的研究提供了参考.