大白菜开花相关基因CO的BAC克隆筛选及分析

根据已经公布的大白菜CO基因(Bra008669)序列设计特异引物,采用三维PCR法筛选大白菜BAC文库,获得了3个含有CO的BAC克隆。对筛选到的3个BAC克隆进行PCR扩增,将克隆测序结果与大白菜CO基因进行序列比对,结果表明,相似性达到99.73%,且N端有保守B-BOX结构,C端有保守的CCT结构域,证明所筛选的3个BAC克隆是含有大白菜CO基因的克隆。     

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。     

香椿(Toona sinensis)微卫星富集文库构建及特性分析

采用Dynal磁珠富集法构建了香椿微卫星富集文库,通过测序结果对文库的特性进行了分析。实验使用改良CTAB法提取香椿基因组DNA,用(AC)8、(AG)8和(ATG)123种带有生物素标记的探针与香椿基因组DNA的酶切片段进行杂交,将磁珠捕获的含有微卫星序列的DNA片段插入p MD 18-T载体,并转入感受态细胞Trans 5α构建克隆,经筛选后得到含356个克隆的香椿基因组微卫星富集文库。从富集文库中挑选插入片段长度为400~800 bp的128个克隆进行测序,其中含有SSR的序列77条,得率达60.16%,其中完美型占82.69%,非完美型8.65%,混合型8.65%。上述结果为SSR位点的进一步开发奠定了基础。     

黏类小麦细胞质雄性不育系mtDNA消减文库的构建

本研究利用抑制性消减杂交技术,构建了黏类小麦细胞质雄性不育线粒体DNA的消减文库。分别提取相同细胞质背景下的不育和可育等基因系线粒体基因组DNA(mtDNA),用RsaⅠ酶切成大小不等的片段,并各自与不同的接头连接,连续经过两次消减杂交和两次PCR扩增,将PCR产物与克隆载体连接,转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建差异DNA消减文库。在构建的不育mtDNA文库中,将SSH文库的全部扩增产物与SSH文库中的单条扩增条带分别进行胶回收和克隆转化,分别挑取54个和6个阳性克隆进行测序分析和相关功能初步比对。结果表明,不育mtDNA的SSH文库差减杂交效率较高,质量较好;回收单条扩增条带分别进行克隆测序的结果准确率较高;对测序序列进行BLASTx比对及功能注释分析发现,约90%的序列来源于线粒体基因nad1和nad5的非编码区。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。     

樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyrl的特异标记开发与遗传作图改进

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性丰效基因位点Tyrl连锁的分子标记.以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Txrl紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆(7A4,4L17和29F20)获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列.从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体(9145 family)构建较高密度的遗传图谱:同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体(9401 family),以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyrl与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离.     

磁珠富集法筛选马尾松微卫星标记

将马尾松核基因组DNA用Sau3A Ⅰ酶切后,电泳回收300～1 000 bp片段.在回收的片段上连接接头PCR后与用生物素标记的微卫星探针(AC)15、(AG)15杂交运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段.将获得的序列通过PCR扩增后,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星序列文库.然后用PCR法直接对文库进行扩增,获得58个阳性克隆,经测序分析,获微卫星序列33个,并成功设计出马尾松微卫星引物19对.     

烟草高分子量核DNA提取方法比较

高分子量(HMW)核DNA的制备是构建BAC文库关键环节之一。为构建高质量的烟草BAC文库,作者研究了一次选择法和二次选择法提取烟草高分子量核DNA的效果。研究结果表明:虽然二次选择法得到的高分子量核DNA浓度较低,但此法省略了对细胞核连续3￣5次的漂洗,而且得到含DNA的凝胶块(plugs)数量是用一次选择法的3倍,因此得到高分子量DNA的总量更高;同时二次选择法得到的plugs纯度更高,排除了酶切时细胞杂质对HMWDNA的干扰,此外在节约材料等方面也优于一次选择法。     

长片段小麦细菌人工染色体DNA亚克隆文库的构建

为了加快小麦基因组的测序,以Langdon库中的一个BAC克隆(BAC790O10)为材料,利用HydroShear DNA剪切仪将其打断,产生许多大小不同的DNA随机片段,回收其中3～5 kb的片段,并将这些片段随机克隆入TOPO载体,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.