胶体金法检测猪旋毛虫病的敏感性研究

将3组试验仔猪分别人工感染旋毛虫幼虫1000条／头、5000条／头和25000条／头,感染后每7d抽血1次,采集全血和血清;感染后46d,将试验猪全部剖杀,取全血、血清和膈肌肉待检。所有样品均用胶体金试纸检测猪旋毛虫抗体和抗原,膈肌肉样品并需用显微镜检查有无旋毛虫包囊。结果表明,最早可于感染后21d,在低感染量试验组的1头仔猪的血清中检出阳性抗体;血清样品的抗体检出率高于全血样品;在血液和血清中未检出虫体抗原;抗体试纸条的检测结果较为准确可靠,而且敏感性明显强于抗原试纸条。建议在检疫检验工作中使用抗体试纸条检测血清或肌肉样品。     

应用原位杂交技术研究母源抗体对PRRS病毒在体内增殖的影响

挑选母源抗体阳性及母源抗体阴性仔猪各2头,人工感染PRRSV,感染后不同时间采集扁桃体、胸腺、脑、肺脏、肩前淋巴结、脾脏、肝脏等组织做成多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片。应用针对PRRS病毒（PRRSV）基因ORF6片段的特异性探针进行原位杂交检测,结果表明,2头母源抗体阴性猪的组织中均可检出病毒阳性信号,而2头母源抗体阳性猪仅可在少数组织中检出病毒阳性信号。以上结果表明,母源抗体会影响同种病毒在体内的增殖。     

番鸭呼肠孤病毒乳胶凝集试验检测方法的建立

建立了用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒(DRV)抗体致敏乳胶检测DRV抗原的方法。通过试验，确定抗体致敏乳胶的最佳浓度为1：10(IgG蛋白浓度为0．4242mg／ml)。最佳致敏温度为37℃。最佳致敏时间为120min。用所建立的方法对人工感染的1日龄雏番鸭30只进行粪便检测。结果表明。感染后第3d粪便中即可检测到病毒．直至人工感染鸭全部死亡都可从粪便中检出病毒抗原；对同样人工感染的30只1日龄雏番鸭的心、肝、脾病料用所建立的方法检测，结果表明．感染后第4d，2／3番鸭脾病料检出阳性；感染后第5d，2只死亡鸭中有1只肝病料检出阳性，脾病料2只都呈阳性；此后的病死鸭脾和肝病料均为阳性，而心则未检出阳性。     

利用棉绳采集口腔液监测猪伪狂犬病方法的应用分析

为分析使用棉绳采集口腔液监测猪场伪狂犬病(PR)方法的科学性,本研究拟通过实验室水平、动物试验及临床应用3个方面对使用棉绳采集口腔液监测猪场PR这一方法开展应用分析。首先对采样条件进行优化,并通过模拟试验测定棉绳对伪狂犬病病毒(PRV)的释放能力,通过动物试验测定病毒感染后检出时间,最后对临床样品进行检测分析。结果表明:使用直径为1.0 cm的棉绳,在早上喂料前采集口腔液样品,采样时间为20~30 min,可采集到更能满足试验要求的口腔液。病毒释放能力测定显示,棉绳对PRV的释放能力为50%左右,使用棉绳采集口腔液可检测到1个TCID50/0.1 mL的病毒含量。动物试验检测发现,猪群在感染后28 d中除第5天外,口腔液中病原含量均高于鼻拭子中病原含量,口腔液检测效果优于鼻拭子,且口腔液中病毒的检出时间(感染后第1天)早于血液中抗体转阳时间(感染后第7天)。临床样品检测分析结果表明,PRV疫苗免疫后也可通过口腔液检测到疫苗毒,并且存在无法通过口腔液检测感染PRV野毒后稳定猪中带毒的情况,因此口腔液检测方法应结合gE抗体检测,才可综合判断猪群是否为感染群体。综上,本研究优化了口腔液采集方法,并测定了棉绳对口腔液的释放能力和感染后检出时间,表明口腔液可作为较好的监测猪群PR的手段;口腔液监测方法需结合gE抗体检测来综合判断猪群是否为感染群体。     

利用棉绳采集口腔液监测猪伪狂犬病方法的应用分析

为分析使用棉绳采集口腔液监测猪场伪狂犬病（PR）方法的科学性,本研究拟通过实验室水平、动物试验及临床应用3个方面对使用棉绳采集口腔液监测猪场PR这一方法开展应用分析。首先对采样条件进行优化,并通过模拟试验测定棉绳对伪狂犬病病毒（PRV）的释放能力,通过动物试验测定病毒感染后检出时间,最后对临床样品进行检测分析。结果表明：使用直径为1.0 cm的棉绳,在早上喂料前采集口腔液样品,采样时间为20~30 min,可采集到更能满足试验要求的口腔液。病毒释放能力测定显示,棉绳对PRV的释放能力为50%左右,使用棉绳采集口腔液可检测到1个TCID₅₀/0.1 mL的病毒含量。动物试验检测发现,猪群在感染后28 d中除第5天外,口腔液中病原含量均高于鼻拭子中病原含量,口腔液检测效果优于鼻拭子,且口腔液中病毒的检出时间（感染后第1天）早于血液中抗体转阳时间（感染后第7天）。临床样品检测分析结果表明,PRV疫苗免疫后也可通过口腔液检测到疫苗毒,并且存在无法通过口腔液检测感染PRV野毒后稳定猪中带毒的情况,因此口腔液检测方法应结合gE抗体检测,才可综合判断猪群是否为感染群体。综上,本研究优化了口腔液采集方法,并测定了棉绳对口腔液的释放能力和感染后检出时间,表明口腔液可作为较好的监测猪群PR的手段;口腔液监测方法需结合gE抗体检测来综合判断猪群是否为感染群体。     

2020年猪场临床主要猪病检测分析与防控建议

2020年齐鲁合作的第三方实验室对猪场送检的样品进行抗原、抗体检测,其中病毒性疾病以猪蓝耳病、猪流行性腹泻、猪圆环病毒2型感染、猪圆环病毒3型感染检出率比较高;而抗体检测结果以伪狂犬病gB抗体、猪圆环病毒2型抗体、猪瘟抗体相对比较理想.但各种疾病表现不同的特点.综合抗原、抗体检测结果看,猪蓝耳病、猪流行性腹泻、猪圆环病...     

兔出血症Dot—ELISA双抗体夹心诊断法及其应用的研究

以建立的斑点酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测兔出血症病毒抗原.结果表明,对23只病兔各脏器病毒抗原检测,以肝、脾的检出率为最高.对人工感染兔各脏器检测,肝脏首先出现病毒抗原,其次是脾脏;各脏器病毒抗原含量依次为,肝>脾>肺>肾>心.用该法从人工感染24h后兔的口腔、鼻腔分泌物及粪便中检出了病毒抗原,表明病兔可通过消化道和呼吸道排毒.与血凝试验对比检测兔出血症可疑标本192份,两者符合率为90.6%.     

旋毛虫感染小鼠对p46 000重组抗原的抗体应答

分别以旋毛虫肌幼虫ES抗原和p46000重组蛋白作为抗原，对小鼠人工感染旋毛虫后的抗体应答进行了ELISA检测。结果表明，以肌幼虫200条／只经口感染小鼠后，肌幼虫ES抗原在感染后9d可检出抗体，并于感染后35～42d达到最高水平；应用重组抗原检测时，感染后10d可检出抗体，抗体水平略低于用ES抗原，但是其消长规律基本一致．而且与阴性血清相比差异明显；抗体在117d后仍维持于较高水平。     

应用BA-Dot-ELISA快速检验旋毛虫病的研究

以旋毛虫肌幼虫层析抗原及国产 BA 试剂建立了快速检验旋毛虫病的 BA-Dot-ELISA。本法采用全血、眼观判定.应用预先制成快诊膜,可在1小时内报告检验结果.BA-Dot-ELISA 检出人工感染猪血清抗体的时间(人工感染后第4天)早于 Dot-ELISA(感染后第7天)和PPA-ELISA(感染后第10天)、与猪囊虫、猪弓形体、猪瘟不发生交叉反应.初步证实了本法具有简、快、敏、特等优点,有助于低水平血清抗体旋毛虫病猪的检测,尤其适合于早期诊断,宰前检查和流行病学调查.     

抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪，血清检测结果显示，机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1)，而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2)。根据各种蛋白质的等电点不同，应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG。分别以纯化的抗PRRSV—GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头，7d后经鼻腔感染PRRSV，定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验。抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；3头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；2头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；2头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；3头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—GP5和抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫作用显著，可作为PRRSV-GP5和PRRSV—M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体，保护机体免受PRRSV的感染。     

囊虫病猪血清CA效价与虫负荷的相关性及CA与Ab的动态观察

应用ELISA双抗体夹心法检测囊虫病猪血清中的循环抗原(CA),对CA效价与虫负荷的相关性作了初步观察,发现两者密切相关.轻度感染猪血清CA效价≤000,中度为1000～10000,重度为10000～100000.人工感染病猪血清一般在感染后1周检出CA,于感染后4～5周达高峰;抗体一般于感染后2周检出.这种方法可检出的最小虫负荷约为20个/猪     

应用干血纸ELISA诊断猪囊虫病的研究

对试验猪用猪囊尾蚴细胞抗原免疫前、感染前、免疫后及用猪带绦虫卵感染后每隔10d经前腔静脉采血1次，分离血清，同时制备全血干血纸，分别用血清ELISA和干血纸ELISA进行检测。结果免疫组猪均在免疫后12d检出抗体；攻击感染组猪在攻击虫卵20d检出抗体，21d抗体水平达高峰，并一直持续到32周；阴性对照组的OD值一直在0.24～0.65。2种样品的检测结果基本一致。     

蓝耳病阴性猪PRRSV攻毒试验结果及在血清驯化中的应用

良圻原种猪场2009年在后备猪采用血清驯化,以保持猪群蓝耳病的稳定。为进一步了解公司内部所用猪蓝耳病病毒的特性,用同一猪蓝耳病病毒的不同拷贝数(0、20、40、400、4 000和20 000)分别对6头蓝耳病抗原抗体双阴性仔猪进行攻毒试验。病原检测:攻毒24h后,除阴性猪外,5头猪均抗原检测到PRRSV病毒核酸,抗体检测;攻毒后的前6 d抗体均为阴性,7 d后攻毒猪只抗体逐渐转阳;第9天抗体全部转阳且较第7天有大幅升高第11天后,整体抗体稍有上升但较缓慢,攻毒21 d后,各猪只抗体值在1.7~2.3之间。表明20个病毒拷贝数就足以感染猪只。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株人工单独感染3头3周龄仔猪，并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2头3周龄仔猪，每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现，并用HerdChek IDExx试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀，PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀，对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM)．用PAM进行抹片，同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明，用所获得的3株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外，用IIF检测7头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片。其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应；对这2头猪的肺组织进行病毒分离。在盲传到第4代时Marc-145细胞上产生明显的细胞病变，进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠，且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

检测猪伪狂犬病血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验方法的建立和评价

以斑点酶联免疫吸附试验(简称 Dot-ELISA)检测128份接种伪狂犬病病毒(PRV)前后的实验猪血清及49头份现地猪血清,并与微量病毒中和试验(MIVN)作比较.结果,Dot-ELISA 能检出抗 PRV 特异抗体,与MIVN 的检出符合率为95.9%,两种方法无显著性差异(P>0.05).Dot-ELISA 检出人工感染猪血清抗体的时间(接毒后第5天)早于 MIVN(接毒后第9天).Dot-ELISA 检测猪血清 PRV 抗体,具有特异性强、敏感性高、快速简便等优点,适合于大批检疫和流行病学调查.     

猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）,用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%（52/56）,对照组猪血清抗体检测均为阴性（33/33）。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。     

非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条检测方法的建立及初步评价

分别以非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白特异性单克隆抗体3E1株和7A7株作为检测抗体和捕获抗体,建立了ASFV抗原试纸条检测方法。该方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对ASFV P72重组蛋白的最低检测量为2.50μg/L;稳定性试验结果表明,试纸条可在2～8℃条件下保存15个月。对100份临床样品的检测结果显示,该方法与荧光定量PCR的符合率为85%。本研究建立的ASFV抗原检测试纸条特异性强、灵敏度高,可用于临床样品中ASFV抗原的检测。     

不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。     

猪呼肠孤病毒感染症的流行与诊断

1流行病学 多种动物呼肠孤病毒都可以人工接种感染易感猪，但在自然条件下较少发生种间感染，猪呼肠孤病毒对猪的感染才是主要的。在普通饲养猪群里，3个血清型猪呼肠孤病毒分布特别广泛，有些地区80%猪体内检出3个血清型的病毒抗体。病毒感染的主要途径是消化道和呼吸道，可经胎盘感染。公猪精液中能分离到病毒，但是否可以引起生殖道感染尚未可知。排毒方式主要是通过病猪的粪便、鼻分泌物及精液，尿液未查出病毒。病毒的抵抗力较强，污染的饲料、饮水和猪舍可长时间存活病毒，为猪群的感染创造了条件。猪只感染病毒后较少发病的原因，可能与体内已有免疫状态相关。感染后很快出现抗体转阳，并持续很长时间，甚至维持终生。新生猪被动获得性免疫抗体可存在11星期，继而抗体消失，成为对猪呼肠孤病毒易感猪，成年猪多数抗体阳性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体NSP7-ELISA检测方法的建立

为了建立区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抗体和灭活疫苗免疫抗体的诊断方法,试验以重组表达蛋白NSP7为抗原,建立检测PRRSV抗体的NSP7-ELISA方法,并对最适反应条件进行确定,然后对猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清和采自长春市的150份血样样品进行检测。结果表明:NSP7-ELISA最佳工作条件为NSP7抗原的最适包被浓度2.0μg/m L,血清稀释度1∶40,酶标抗体的工作浓度1∶5 000,以5%脱脂奶粉封闭过夜;猪瘟病毒等5种猪常见病毒感染阳性血清的检测结果均为阴性;在150份血清样本检测中,敏感性、特异性和符合率分别为88.1%(37/42)、90.7%(98/108)、90.0%(135/150)。说明建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于区分PRRSV感染抗体和灭活疫苗免疫抗体。