拟南芥中 Fibrillarin 基因的克隆.表达.纯化及与 ak6 蛋白相互作用研究

[目的]研究拟南芥中Fibdllarin基因的克隆、表达及纯化，并探索其与ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX-6P-1与Fibrilla—r流基因构建重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，运用同样方法构建PET-28a—ak6原核表达质粒，获得His—ak6融合蛋白，并运用体外pulldown技术验证二者的相互作用。f结果l在温度为37℃、诱导时间为16～20h、IPTG浓度为0．5mmol／L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。试验成功获得了符合标准的RNA，并获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带；pull—down试验结果表明，拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。[结论]拟南芥ak6突变体植株可能由于ak6的缺失影响了rRNA前体的加工，从而抑制核糖体的合成，进而阻碍拟南芥茎的生长，使植株表现明显的矮小症状。     

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

传染性鼻气管炎病毒gE基因的表达与免疫原性

[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。     

重组死亡素-蜂毒素杂合肽表达·分离纯化的研究

[目的]采用pET-28a系统包涵体表达死亡素-蜂毒素杂合肽。[方法]将死亡素基因重组到pET-28a质粒上,转化到大肠杆菌BL21中构建基因工程菌,SDS-PAGE电泳检测工程菌诱导表达时间,亲和层析纯化目的蛋白。[结果]表达的目的蛋白为包涵体,工程菌诱导表达时间8h最佳。[结论]包涵体方式表达死亡素-蜂毒素可以获得较高的表达量,纯化后蛋白纯度较高。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

PCV2·ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

一个耐硒基因过表达载体的构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步验证WRKY47基因在调控硒胁迫应答中的功能,构建WRKY47过表达载体,获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的c DNA为模板,利用PCR扩增WRKY47基因全长,将该基因连接到p BI121载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸化转化法将WRKY47重组质粒转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得WRKY47转基因阳性植株。[结果]扩增获得WRKY47基因,CDS全长1 470 bp,连接转化并获得测序正确的重组载体p BI121-WRKY47。通过抗性筛选和分子鉴定获得阳性转基因植株。[结论]成功构建过表达载体并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。     

拟南芥SPM12基因GFP载体构建及转基因植株筛选

[目的]为了进一步研究SPM12基因的功能,利用哥伦比亚(Columbia,Col)遗传背景的野生型拟南芥材料构建SPM12基因GFP载体及其转基因植株。[方法]以野生型拟南芥的RNA反转录成的cDNA为模板,PCR扩增出SPM12基因的CDS全长序列,将其连接到GFP载体的质粒上;然后将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α受态细胞中,挑取阳性菌落经PCR鉴定并测序后,将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。PCR鉴定出阳性菌落后,通过浸花法将其转入野生型拟南芥植株中。收种子后,使用带有抗性的选择性培养基筛选出阳性植株。[结果]通过SPM12基因CDS片段和SPM12-GFP重组质粒的获得,构建了SPM12-GFP载体和其转基因植株。[结论]成功获得拟南芥SPM12-GFP转基因植株,为进一步研究拟南芥SPM12基因的功能与分子机制奠定了基础。     

猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原.     

肉鸡谷胱甘肽S-转移酶A3基因的克隆及蛋白的表达和纯化

[目的]谷胱甘肽S-转移酶A3(GSTA3)是GSTs超家族中α家族的一员,具有解毒功能,同时还参与抗氧化应激引起的信号通路调节,另外在类固醇和前列腺素的合成中也必不可少。[方法]本试验采用RT-PCR方法扩增肉鸡GSTA3基因,连接pZeroBack/blunk克隆质粒,再与表达载体pET-28a连接,并转入E.coli BL21(DE3)中获得pET-28a-GSTA3重组表达质粒,使用IPTG诱导其蛋白的表达,应用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并对其进行SDS-PAGE鉴定,使用谷胱甘肽-S转移酶活性测定试剂盒对重组蛋白进行活性检测。[结果]试验成功构建重组表达质粒pET-28a-GSTA3,并在大肠杆菌中成功表达,其大小为29.6 kDa,与预期一致,并且表达的重组GSTA3蛋白具有生物活性。[结论]本试验成功获得高纯度的可溶性GSTA3融合蛋白,为其在家禽领域的进一步研究奠定了基础。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

拟南芥CTSP3基因GUS载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制,以野生型拟南芥为材料构建CTSP3-GUS重组质粒及GUS转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的DNA,克隆其启动区基因片段,将基因片段和pART27-GUS质粒双酶切后连接,转化到大肠杆菌感受态细胞中,菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将CTSP3-GUS重组质粒转入农杆菌感受态GV3101,获得阳性单菌落。接着采用浸花法侵染野生型拟南芥,最后通过抗性筛选和PCR鉴定获取CTSP3-GUS转基因植株。[结果]成功克隆CTSP3启动区基因片段,构建出重组质粒,获得了CTSP3-GUS转基因植株。[结论]获得CTSP3-GUS转基因植株,为接下来进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。