水稻抑制差减杂交技术中叶片总RNA提取方法的探讨

为建立水稻抑制差减杂交技术中叶片总RNA最佳的提取方法,以5叶期水稻品种合江19为提取总RNA的材料,对Trizol法和两种改良Trizol法提取的水稻叶片总RNA纯度和完整性进行了比较研究。基因定量仪检测结果表明,Trizol法、改良Trizol法Ⅰ和改良Trizol法Ⅱ提取的RNAOD（260／280）分别为1．529、1．755和1．991;琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,改良Trizol法Ⅱ提取的RNA具有28s、18s和5s3条清晰的条带,且无降解,而其他两种方法提取的RNA质量较差,均有降解。该研究结果说明改良Trizol法Ⅱ提取的RNA完整性好和纯度较高,该方法优于Trizol法。     

2种荔枝RNA提取方法的比较

比较利用TRIZOL法和改进SDS法2种方法提取荔枝叶片总RNA的可行性。通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测,对提取所得RNA的完整性、纯度及浓度进行分析。试验结果表明,改进SDS法适合荔枝叶片总RNA的提取,能有效获得纯度高、完整性好的RNA样品。     

梨叶片总蛋白提取及双向电泳体系的建立

【目的】探索建立有效的梨叶片蛋白质组双向电泳体系,为梨蛋白质组的后续研究提供参考。【方法】以早酥梨叶片为材料,比较蛋白质提取方法、蛋白质裂解时间、IPG胶条的pH梯度和长度、等电聚焦程序及SDSPAGE电泳参数对梨叶片蛋白双向电泳结果的影响。【结果】采用第2种改良的三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取梨叶片总蛋白,蛋白质裂解1 h,选用长17 cm、pH 4～7的IPG 胶条及聚焦程序Ⅱ进行等电聚焦,于100 V 30 min、180 V 6 h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适用于梨叶片蛋白质组分析的双向电泳体系。     

辣椒叶片总RNA提取与质量分析

用3种不同方法提取辣椒叶片的总RNA,研究辣椒叶龄和基因型对总RNA提取的影响和筛选辣椒总RNA提取的最佳方法.结果表明,方法2为辣椒叶片总RNA提取的最佳方法;从新叶中提取的总RNA的亮度高,完整性最好,中龄叶次之,老叶最差;辣椒材料0860-1总RNA的28 S和18 S条带明亮,质量浓度最高,材料0876和08122的这些条带较暗,质量浓度低.     

口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

旨在建立口蹄疫病毒可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。以猪口蹄疫灭活疫苗为材料,设计两对RT-LAMP引物,建立FMDV可视化RT-LAMP检测方法,并与普通PCR检测方法进行比较,同时进行特异性试验和敏感性试验。对从油佐剂疫苗中提取FMDV核酸方法进行比较结果发现,用商品化试剂盒提取时,3种样品处理方法对病毒RNA提取量没有显著影响;Trizol法提取RNA时,从油佐剂疫苗中直接提取,获得的RNA量最大,与其他2种方法差异极显著(P0.01)。建立了口蹄疫病毒可视化RT-LAMP方法,该方法检测到模板RNA最低稀释度为10-9,比RT-PCR方法灵敏10倍,特异性好。     

New approach to border line evaluations for whole sample of Williams pear (Pyrus communis)

In many processes of heat exchange, as well as in other processes of biomaterial handling, physical properties of fruit such as dimensions, shape, surface area and volume are of crucial importance. The objective of this work was to find a function which approximates pear border line, as precisely as possible, in order to calculate the surface area and volume of a pear by means of integral calculus. Previously described estimation of an average pear border line was based on the sixth order polynomial and proposed algorithm. Two new ways to calculate the Williams pear border line are the focus of this study. The first way includes spline functions as an estimation of a pear border line (i.e. four third order polynomials), while the second one uses regression function obtained by nonlinear regression method. The regression function has two independent variables, length and total length of a pear. The most precise approximation of a pear border line was obtained by nonlinear regression with R² = 97.48. This was more obvious when total pear length was smaller or greater than average total pear length. Border lines of all tested pears were determined by one regression function with large precision. Therefore, it is safe to calculate surface area and volume of a pear based on regression function and total pear length, only. Calculated volumes of the pears were compared with volumes measured by Archimedes’ method. The smallest relative error has been obtained when the volumes were calculated using the regression function as approximation of pear border line.     

3种梨树病毒cDNA探针检测

利用Biotin-16-dUTP标记的cDNA探针分子杂交检测分析了新疆梨树上的3种主要病毒(梨环纹花叶病毒、梨脉黄病毒、苹果茎沟病毒)并优化了杂交反应体系。结果表明,这3种病毒探针的检测灵敏度分别为5、10和10 pg。用文中的方法提取的RNA均能在10-3稀释后显色。该方法与RT-PCR方法对样品带毒状况的检测结果一致。     

应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

【目的】甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害,是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的。论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播。【方法】以Gen Bank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因序列为靶标,设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针,建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系。以保存的目的菌株为材料,提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化。利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测,测定该体系的特异性。将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释,依次稀释为1 ng·μL~(-1)、100 pg·μL~(-1)、10 pg·μL~(-1)、1 pg·μL~(-1)、100 fg·μL~(-1)、10 fg·μL~(-1)和1 fg·μL~(-1)作为模板,利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,测定灵敏度。将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系,将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上,将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成c Zipcode(检测探针),检测探针(c Zipcode)用地高辛标记后与产物进行杂交。锁式探针结合斑点杂交技术分别进行特异性检测和灵敏度测定。探针与斑点杂交技术结合建立的高通量检测体系进行人工模拟种子带菌检测,进一步验证该体系的可靠性。利用建立的高通量检测方法对205份市售疑似带病的甜瓜种子进行检测。【结果】锁式探针特异性测定结果表明,26株甜瓜细菌性叶斑病菌均能得到一条105 bp的特异性条带,而剩余25株参试菌株及无菌水均无扩增产物产生。灵敏度测定结果表明,当目的菌株的浓度稀释为1 pg·μL~(-1)时均能检测到一条105 bp的特异性条带,所以探针的检测灵敏度为1 pg·μL~(-1)。探针与斑点杂交技术结合建立的检测甜瓜细菌性叶斑病菌高通量体系能将甜瓜细菌性叶斑病与所有的参试菌种区分开,26株甜瓜细菌性叶斑病菌杂交后出现了显色反应,而25株参试菌株及无菌水均没有发生显色。锁式探针结合斑点杂交的灵敏度检测同样达到1 pg·μL~(-1)。将锁式探针结合斑点杂交进行人工模拟种子带菌检测,能将1粒带菌种子从1 000粒健康的种子检测出来,模拟种子带菌检测率都能达到0.1%(1/1 000)。从205份市售甜瓜种子中成功检测到7份市售种子带菌。将带菌种子分别加入一定量的无菌水浸泡4 h,提取悬液DNA,将悬液DNA进行PCR扩增后测序,NCBI比对后确定为甜瓜细菌性叶斑病菌。【结论】基于锁式探针结合斑点杂交技术的检测体系能够快速、准确地识别甜瓜细菌性叶斑病。     

梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究

【目的】克隆梨NAC结构域蛋白基因NACP,验证其mRNA是否可以通过韧皮部进行嫁接传递。【方法】利用同源克隆的方法,分别克隆‘鸭梨’(Pyrus bretschneideri Yali)和杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)的NACP基因,利用生物信息学方法进行序列分析。以‘鸭梨’为接穗,杜梨为砧木进行微嫁接。从接穗茎尖、叶片、茎段韧皮部,嫁接口及砧木韧皮部、木质部组织中提取RNA,进行RT-PCR扩增。用特异的限制性内切酶ScrFⅠ对其扩增产物进行酶切鉴定。利用原位杂交技术,检测NACP基因在植物体内的表达部位。【结果】获得‘鸭梨’和杜梨NACP基因全长序列,长度均为1377bp,编码350个氨基酸,包含两个内含子,大小分别为111、96bp,分别命名为YL-NACP和DL-NACP。酶切鉴定结果表明,在接穗‘鸭梨’茎尖、叶片、茎段韧皮部中都有砧木DL-NACP基因的mRNA表达,同时砧木杜梨韧皮部中也有接穗YL-NACP基因的mRNA表达,而木质部中则没有发现该基因表达。通过原位杂交进一步证明,NACP基因只定位于韧皮部。【结论】成功地从‘鸭梨’和杜梨中克隆了全长的NAC结构域蛋白基因NACP,并进一步证明了梨内源性的NACP基因mRNA可以通过韧皮部进行传递,该结果为进一步研究果树砧木与接穗的互作机制奠定了基础。     

鱼腥草叶片总RNA提取方法研究

[目的]筛选出适合鱼腥草（Houttuynia cordata）叶片RNA提取的方法。[方法]以鱼腥草叶片为材料,比较了经典RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒A、Trizol试剂盒B以及富含多糖类材料RNA提取试剂盒提取鱼腥草RNA的效果。[结果]Trizol试剂盒A、Trizol试剂盒B和经典RNA提取试剂盒难以提取出高质量的RNA,而富含多糖类材料RNA提取试剂盒提出的RNA质量高,完整性好,可以满足进一步分子生物学研究的要求。[结论]普通RNA提取试剂盒难以提取出鱼腥草叶片的RNA。     

细菌总RNA提取方法的研究进展

总RNA的提取是进行实时荧光定量PCR,Nothem杂交分析,cDNA文库的建立等分子生物学研究的基础.概述了目前国内外细菌总RNA提取方法的现状,对提取过程中的常见问题进行了分析,并且对其未来的发展趋势进行了展望.     

Adventitious shoot regeneration from the leaves of in vitro grown ‘Zhongli 1’ pear (Pyrus spp.)

The pear (Pyrus spp.) is one of the most important temperate fruit crops. The technique of adventitious shoot regeneration from leaves is considered to be one of the shortcuts in the research on pear genetic modification and cellular engineering, which, however, has not been widely used. As the regeneration frequency of pear leaves is usually very low, the research on adventitious shoot regeneration from pear leaves is eagerly needed. In this experiment, the factors affecting shoot and bud regeneration from the leaves of ‘Zhongli 1’ pear were studied, and an efficient protocol for shoot regeneration was established. The results showed that different types of basic media, different combinations of plant growth regulators, leaf placement on medium, periods of dark culture and the use of silver nitrate (AgNO₃) on culture media all significantly affected the adventitious shoot regeneration frequency of ‘Zhongli 1’ pear. The details are as follows: (1) Among three kinds of basic media, NN69 was better for ‘Zhongli 1’ shoot regeneration, followed by half (½) MS, while full MS had no effect on shoot regeneration; (2) Thidiazuron (TDZ) was better than 6-benzylaminopurine (6-BA) for ‘Zhongli 1’ regeneration, with an optimal concentration of 1.5 mg · L^?1, and the regeneration rate under this concentration could reach 85%, with 2.72 buds per leaf. 0.5 mg · L^?1 indole-3-butyric acid (IBA), which induced a higher regeneration frequency, was a better choice for pear regeneration compared with 0.3 mg · L^?1 naphthaleneacetic acid (NAA). Among the different combinations of plant growth regulators, TDZ + IBA was better for inducing high regeneration frequency; (3) The abaxial surface of leaves touching the medium was beneficial for leaves to uptake nutrients from the medium, and because of that, the regeneration frequency of leaves was significantly higher than that of leaves touching the medium with their adaxial surfaces (obverse side of leaf); (4) Dark culture was necessary for bud regeneration, and the best duration for dark culture of ‘Zhongli 1’ pear was 21 days; (5) The addition of 1.0 mg · L^?1 AgNO₃ into the culture medium could promote adventitious shoot regeneration significantly. A high adventitious shoot regeneration frequency was obtained in this research, which will be beneficial for further research on efficient and stable in vitro plant regeneration systems and genetic modification of pear.     

玫瑰花柱总RNA提取方法的比较研究

为获得一种玫瑰(Rosa rugosa)花柱总RNA提取的理想方法,为后续相关基因工程研究奠定基础。以玫瑰花柱为材料,用核酸蛋白仪和凝胶电泳法比较了改良CTAB 法、Trizol 法以及EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的玫瑰花柱总RNA的纯度、浓度及完整性,利用RT-PCR反应检测了其反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明：改良CTAB法提取的总RNA纯度、浓度较高,但存在严重降解现象;Trizol 法提取的总RNA纯度和浓度极低;EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的总RNA纯度和浓度较高,条带清晰,且28S 条带亮度是18S 条带亮度的2 倍,将其反转录获得的cDNA用于RT-PCR,能够扩增出清晰的特异性条带。综上所述：EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法从玫瑰花柱中提取的RNA质量最好,完全能够满足后续的玫瑰分子生物学研究要求。     

滇杨叶芽总RNA提取方法比较研究

 采用改良CTAB法、硼砂/CTAB法、酚/SDS法、皂土法和2种总RNA提取试剂盒共6种方法提取滇杨叶芽总RNA,并通过紫外分光光度计测定RNA样品的纯度,琼脂糖凝胶电泳和cDNA AFLP检测总RNA样品的完整性和质量。结果表明,硼砂/CTAB法和皂土法不适合滇杨叶芽总RNA的提取。改良CTAB法、酚/SDS法和2种试剂盒均能得到清晰的28S和18S条带。其中,改良CTAB法提取的滇杨叶芽总RNA完整性最好,OD260/OD280值在1.8-2.0之间,OD260/OD230值>2.0,经过cDNA-AFLP扩增分析,获得了清晰的条带。结果证明,改良CTAB法提取的滇杨叶芽总RNA能够满足RT-PCR等分子生物学实验。     

云南栘［木衣］叶片总RNA提取方法的比较与改进

高质量RNA的提取是开展云南栘［木衣］分子生物学研究的前提。采用OMEGA (Plant RNA Kit 50)试剂盒、TIANGEN(TRNzol-A+Reagent)试剂盒、CTAB法、Trizol法、SDS法及其改良法6种方法提取云南栘［木衣］叶片的RNA,并用琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白检测仪及RT-PCR技术比较了6种不同方法提取的总RNA样品的质量。结果表明,2种试剂盒法和trizol法不适合云南栘［木衣］RNA提取,无法得到28S、18SrRNA条带,CTAB法和SDS法虽能得到RNA的3条带,但拖带现象严重,A₂₆₀/A₂₃₀的比值较低,对SDS法进行改进,提高β-巯基乙醇的量,在缓冲液中增加PVP,使用HiBind RNA Mini柱,有效地抑制多酚多糖的污染,得到了较高质量、可用于RT-PCR扩增的云南栘［木衣］的RNA。对其开展分子生物学研究提供技术支撑。     

梨树叶片黄化与根际土壤微生物及养分关系

以甘肃景泰叶片黄化梨园土壤为例,比较黄化和非黄化梨园0～20 cm和20～40 cm土壤微生物及养分,以探讨与梨树叶片黄化相关因子,为解决黄化问题提供科学依据。研究表明：黄化土壤细菌、放线菌数量都显著少于非黄化土壤的数量,浅层（0～20 cm）黄化土壤的细菌数量少于非黄化土的4662%,放线菌数量少5249%;深层（20～40 cm）黄化土的细菌数量少于非黄化土的7822%,放线菌少5013%。两者的真菌数量差异不显著。黄化土壤20～40 cm的有机质、全氮、全铁、全镁含量显著低于非黄化土壤和黄化土壤0～20 cm土层的含量。因此,梨树叶片黄化与土壤中细菌、放线菌数量减少、20～40 cm土层的有机质、全氮、全铁、全镁含量过低有关。建议重点增施黄化梨园20～40 cm土层的腐熟有机肥。     

草石蚕块茎总RNA提取及质量分析

采用3种方法提取草石蚕块茎的总RNA,以期筛选出适合草石蚕块茎总RNA提取的最佳方法。结果表明,RNAiso Reagent法提取草石蚕块茎总RNA的28S和18S条带清晰明亮,RNA无降解,无DNA污染,质量较好。王艳红法和TRIzolR Reagent一步提取法提取总RNA的28S和18S条带较暗,提取的总RNA有降解现象。根据紫外分光光度计检测结果分析,3种方法提取草石蚕块茎总RNA的纯度都较好。从提取RNA的产量来看,RNAiso Reagent法提取总RNA的浓度最高,为1112μg/mL,王艳红法次之,TRIzolR Reagent一步提取法最低。因此,RNAiso Reagent法是草石蚕块茎总RNA提取的最佳方法。     

不同土壤镉提取方法预测稻米富集镉性能评估

为筛选土壤镉(Cd)有效态提取方法并建立其与稻米Cd污染之间的累积模型,采用大田协同采样方式收集了土壤-水稻140对样品,分别研究了土壤Cd总量及土壤溶液Cd含量和化学浸提(醋酸HAc、复合有机酸、乙二胺四乙酸EDTA、CaCl2)、梯度扩散薄膜(DGT)技术提取的Cd含量与水稻糙米Cd含量的相关性,以评估不同提取方法预测稻米Cd累积模型的可行性。结果表明,研究区所在的长株潭地区存在较为明显的土壤及稻米Cd污染风险,EDTA提取Cd含量与土壤Cd总量显著正相关,模型拟合决定系数R2达到0.908 4,以总量预测稻米Cd污染存在37.2%~39.8%的误判率,0.01 mol·L^-1CaCl2提取的土壤Cd有效态含量存在明显的适用范围限制,在0.04~0.13 mg·kg^-1范围内,效果明显差于其他数据区域,模型决定系数R2仅为0.006。DGT技术能较好地预测稻米对Cd的吸收富集性能,且能区分土壤库供给能力差异对稻米富集Cd的影响,与传统化学浸提方法比较,DGT技术提取的土壤Cd有效态含量与稻米Cd含量具有更好的相关性(R^2=0.585 4,0.900 9),是预测稻米富集Cd较为理想的土壤有效态提取方法。     

适用于转录组测序的大豆根总RNA的提取方法研究

[目的]获得高质量、高产量并能满足转录组测序要求的大豆根总RNA。[方法]比较分析了Trizol法、CTAB-Li Cl法和试剂盒法的提取效果。[结果]3种方法均能从大豆根中提取出总RNA。但与Trizol法、CTAB法相比,试剂盒法提取的大豆根总RNA纯度高、完整性好,平均浓度达413.9 ng/μL,A260/A280≈2.14,A260/A230≈2.10,方法可重复性好。[结论]试剂盒法提取的RNA满足转录组测序的质量要求,可进行后续的转录组测序和其他分子生物学相关研究工作。