Erratum

The fourth sentence of the abstract of the report "The elav gene product of Drosophila, required in neurons, has three RNP consensus motifs" by S. Robinow et al. (16 Dec., p. 1570), should have read, "DNA sequence data presented in this report suggest that the elav gene product is an RNA binding protein, based on the presence of RNP (ribonucleoprotein) consensus sequences."     

河南良杂猪白细胞介素-18成熟蛋白基因的克隆及表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18基因成熟蛋白序列.序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-IL18,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确.     

青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3ˊ端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾（顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花）和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,GenBank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框（ORF）,编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系（R=0.96,P<0.05）,CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

猪骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及序列分析

克隆猪骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽基因。通过提取猪肾的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出目的基因,并将其回收后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行阳性克隆的筛选与鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物,显示结果与预期片段大小一致,质粒PCR检测、酶切鉴定证实重组克隆中插入了PCR产物,测序结果揭示BMP-4成熟肽cDNA长为351bp,编码116个氨基酸。序列对比表明,猪与人、小鼠、牛、绵羊BMP-4成熟肽cDNA序列的同源性分别为94.87%、90.60%、94.87%、94.59%,而相应的氨基酸同源性分别为99.12%,99.12%,100%、100%。首次成功地克隆了猪BMP-4成熟肽编码基因,对于进一步研究猪BMP-4全基因结构、功能及其与繁殖性能的关系有重要的意义。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建

从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。     

番荔枝花器官发育基因AsAG的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从番荔枝中分离花器官特征决定基因AGAMOUS,并进行亚细胞定位及基因表达分析,为进一步研究该基因参与调控花发育调控的分子机理,及解决番荔枝花发育异常问题奠定基础。【方法】以番荔枝成熟花为材料,通过试剂盒提取总RNA,并以RACE方法克隆获得基因AG的全长序列。序列拼接和氨基酸序列分析采用DNAMAN软件;相似性分析通过BLASTn和BLASTp程序进行;进化树构建采用MEGA 5.1软件;蛋白质二级结构预测与3D结构建模分别采用ExPaSy的SOPMA和Phyre2程序进行;亚细胞定位表达采用烟草上皮细胞瞬时转染系统和基因枪轰击洋葱表皮细胞方法;AG在花发育不同时期、不同器官及不同激素信号分子处理下的表达特性分析,利用实时荧光定量RT-PCR方法。【结果】从番荔枝中克隆得到AGAMOUS,其cDNA全长ORF序列长度为669 bp,编码222个氨基酸,命名为AsAG,序列提交到GenBank（登录号为KT159768）。二级结构预测发现AsAG所编码蛋白由延伸链结构（俄extended strand）、α-螺旋（alpha helix）、β-转角（beta turn）和不规则卷曲（random coil）组成,四者比例分别为14.41%、59.46%、8.11%和18.02%。生物信息学分析显示AsAG编码的蛋白与海枣（XP 008781978.1）、芦笋（BAD83772.1）、拟南芥（AT4G18960）、油棕（XP 010912706.1）、山玉兰（AFH74390.1）、石斛（ABQ08574.1）、红花玉兰（AEO52692.1）等同源蛋白的相似度达79%-84%。ASAG蛋白含有一个高度保守的MADS-box结构域和一个次级保守的K区,该蛋白分子量为25.7 kDa,等电点为9.15,为稳定蛋白,无信号肽。亚细胞定位显示AsAG编码蛋白定位于细胞核。实时定量RT-PCR结果表明,AsAG在不同的器官中表达量存在差异,在花中表达量最高。AsAG在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,而在花蕾期Ⅳ中表达量最高。进一步分析发现AsAG的表达水平呈现花器官特异性分布（雄蕊＞雌蕊＞萼片＞花瓣）。进一步研究表明,AsAG在畸形花中的表达量低于正常花。检测GA和ABA等不同信号分子分别处理番荔枝花芽2 h和4 h后AsAG的表达量,结果表明AsAG的表达受GA负调控,受ABA正调控。【结论】推测番荔枝AsAG可能参与雌蕊和雄蕊的发育及激素信号的响应。     

猪IL-18成熟蛋白基因重组真核表达载体的构建及其抗病毒作用研究

应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体pcDNA3.1,成功构建了pmIL-18基因的重组真核表达载体pcD-NA3/pmIL-18。将重组质粒转染COS7细胞,经SDS-PAGE及Western-blotting分析表明,pmIL-18基因在COS7细胞中获得了瞬时表达。收集转染细胞培养上清,检测pmIL-18抗病毒活性,结果表明,转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒没有明显的抑制作用。     

Molecular cloning of the complementary DNA for human tumor necrosis factor

Tumor necrosis factor (TNF) is a soluble protein that causes damage to tumor cells but has no effect on normal cells. Human TNF was purified to apparent homogeneity as a 17.3-kilodalton protein from HL-60 leukemia cells and showed cytotoxic and cytostatic activities against various human tumor cell lines. The amino acid sequence was determined for the amino terminal end of the purified protein, and oligodeoxyribonucleotide probes were synthesized on the basis of this sequence. Complementary DNA (cDNA) encoding human TNF was cloned from induced HL-60 messenger RNA and was confirmed by hybrid-selection assay, direct expression in COS-7 cells, and nucleotide sequence analysis. The human TNF cDNA is 1585 base pairs in length and encodes a protein of 233 amino acids. The mature protein begins at residue 77, leaving a long leader sequence of 76 amino acids. Expression of high levels of human TNF in Escherichia coli was accomplished under control of the bacteriophage lambda PL promoter and gene N ribosome binding site.     

大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA克隆及其真核表达载体的构建

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法克隆大鳞副泥鳅生长激素基因(pGH)cDNA。结果表明,克隆到的pGH的开放阅读框包括633 bp,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,GenBank注册号为DQ350432。把pGH成熟肽的cDNA插入真核表达载体pPIC3.5K,PCR技术、酶切和测序证明重组子中确实定向插入了pGH成熟肽片段;将重组的pPIC3.5K-pGH用SalⅠ酶切后,转化巴斯德毕赤酵母GS115,PCR技术筛选证明pGH已经整合到酵母染色体上。从而成功克隆大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA,并构建了胞内真核表达载体pPIC3.5K-pGH。     

梅花鹿VEGF基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了得到VEGF成熟肽基因,利用Trizol试剂法提取鹿茸顶端组织总RNA,反转录形成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关基因序列设计1对特异性引物,并克隆VEGF成熟肽基因,再利用免疫组化法检测VEGF基因在鹿茸顶端不同组织的表达水平。结果表明:成功获得梅花鹿VEGF成熟肽基因,该基因长495 bp,共编码164个氨基酸;经Blast同源性分析,结果显示与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.79%、97.98%、96.36%;经DNAMAN软件比对,其氨基酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%。免疫组化法结果显示,VEGF在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,其中在软骨层中表达水平较高。     

Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence

Lipoprotein lipase is a key enzyme of lipid metabolism that acts to hydrolyze triglycerides, providing free fatty acids for cells and affecting the maturation of circulating lipoproteins. It has been proposed that the enzyme plays a role in the development of obesity and atherosclerosis. The human enzyme has been difficult to purify and its protein sequence was heretofore undetermined. A complementary DNA for human lipoprotein lipase that codes for a mature protein of 448 amino acids has now been cloned and sequenced. Analysis of the sequence indicates that human lipoprotein lipase, hepatic lipase, and pancreatic lipase are members of a gene family. Two distinct species of lipoprotein lipase messenger RNA that arise from alternative sites of 3'-terminal polyadenylation were detected in several different tissues.     

Chromosomal rearrangement generating a composite gene for a developmental transcription factor

Differential gene expression in the mother cell chamber of sporulating cells of Bacillus subtilis is determined in part by an RNA polymerase sigma factor called sigma K (or sigma 27). The sigma K factor was assigned as the product of the sporulation gene spoIVCB on the basis of the partial aminoterminal amino acid sequence of the purified protein. The spoIVCB gene is now shown to be a truncated gene capable of specifying only the amino terminal half of sigma K. The carboxyl terminal half is specified by another sporulation gene, spoIIIC, to which spoIVCB becomes joined inframe at an intermediate stage of sporulation by site-specific recombination within a 5-base pair repeated sequence. Juxtaposition of spoIVCB and spoIIIC need not be reversible in that the mother cell and its chromosome are discarded at the end of the developmental cycle. The rearrangement of chromosomal DNA could account for the presence of sigma K selectively in the mother cell and may be a precedent for the generation of cell type-specific regulatory proteins in other developmental systems where cells undergo terminal differentiation.     

Ⅱ型内含子介导的基因打靶技术及应用前景

Ⅱ型内含子除具有核酶的特性之外,还可作为一种可移动的元件特异性地转移到基因组序列中,其转移过程需要内含子RNA和内含子编码蛋白质（IEP）来识别靶标位点,内含子已经作为一种新型的基因打靶工具应用于原核生物的基因插入失活和特定的基因敲除,并在真核生物基因组的功能基因组学和基因治疗中展现了广阔的应用前景。     

水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析水牛朊蛋白（prion protein，PrP）成熟片段基因，并获取纯化的表达产物。【方法】将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a，并分析其序列；把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3)，鉴定纯化的表达产物。【结果】水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上，并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列，编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后，用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。【结论】首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，发现水牛成熟PrP有5个重复序列，并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。     

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

A persistent untranslated sequence within bacteriophage T4 DNA topoisomerase gene 60

A 50-nucleotide untranslated region is shown to be present within the coding sequence of Escherichia coli bacteriophage T4 gene 60, which encodes one of the subunits for its type II DNA topoisomerase. This interruption is part of the transcribed messenger RNA and appears not to be removed before translation. Thus, the usual colinearity between messenger RNA and the encoded protein sequence apparently does not exist in this case. The interruption is bracketed by a direct repeat of five base pairs. A mechanism is proposed in which folding of the untranslated region brings together codons separated by the interruption so that the elongating ribosome may skip the 50 nucleotides during translation. The alternative possibility, that the protein is efficiently translated from a very minor and undetectable form of processed messenger RNA, seems unlikely, but has not been completely ruled out.