诱导多能干细胞的免疫原性

诱导多能干细胞(iPSCs)是由体细胞经过特定的因子诱导重编程而来,它作为细胞更新的来源在再生医学上有着很大的应用前景。人们普遍认为产生iPSCs的个体不会排斥这种自体同源的细胞,但是它们的免疫原性没有被真正的检测过。美国加州     

二氧化硫胁迫诱导拟南芥NIT2基因DNA甲基化修饰

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式。利用亚硫酸氢盐修饰后测序法和甲基化敏感性限制性内切酶-PCR（MSRE-PCR）法,研究SO2胁迫对拟南芥腈水解酶（NIT2）基因序列中胞嘧啶甲基化状态的影响,分析甲基化特征改变在植物胁迫应答过程中的作用。研究发现,30 mg.m-3的SO2连续熏气3 d后,拟南芥植株地上组织细胞中NIT2基因启动子区域CG和CHH（H为C,A或T）位点甲基化水平下降,总甲基化水平降低,但未检出编码区5′端目的片段中CCGG位点甲基化状态的改变。RT-PCR分析表明,SO2胁迫组拟南芥植株地上组织细胞中NIT2基因的转录水平高于对照组。研究结果表明,SO2胁迫导致拟南芥NIT2基因启动子区甲基化水平降低,NIT2基因转录上调,说明SO2胁迫能诱发拟南芥基因胞嘧啶甲基化水平改变,启动子区甲基化水平的降低可能与防御基因的诱导表达有关,胞嘧啶甲基化修饰参与了植物的抗逆生理过程。     

四环素调控基因(TetO)诱导重编程的猪体细胞系建立

建立含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA的第二代猪(Sus scrofa domesticus)成纤维细胞,使其在添加强力霉素(doxycycline,DOX)而无需再次感染病毒的条件下可以重编程。将慢病毒(Lentiviral)质粒四环素调控基因(TetO)-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF),在添加DOX的培养条件下,形成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。随后,将iPSCs通过形成拟胚体(embryoid body,EB)再分化为成纤维样细胞,即TetO-PEF细胞。TetO-PEF携带TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA两个载体,且外源四因子拷贝数一致,在+DOX条件下调控四因子表达,直接驱动细胞重编程。本研究建立了TetO-PEF细胞系,为优化猪iPSCs培养条件提供了新的细胞资源。     

丙戊酸对体外培养牛胎儿成纤维细胞周期的影响

丙戊酸(valproic acid,VPA)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,能提高细胞内组蛋白乙酰化水平,影响基因的表达.为探讨VPA对体细胞生长的影响,本实验以牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞为研究对象,利用流式细胞技术探讨VPA处理牛体细胞对其细胞周期的影响,并利用Real-time PCR检测VPA处理后细胞转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达变化的影响.结果显示,体细胞经0.8、1.0和2.0mmol/L的VPA分别处理24、48和72 h后,随VPA浓度的增加,体细胞增殖减缓,细胞周期抑制在间期0/间期1 (G0/G1)期.对转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达量的检测表明,与未处理组相比VPA处理后细胞Oct4和Nanog的表达量提高,而Cdx2基因的表达量降低.研究结果表明,VPA处理能够改变成纤维细胞的生长特性和基因表达状态,本研究牛体细胞核移植胚胎表观重编程及发育研究提供了参考资料.     

小鼠生殖细胞特异基因Oct4启动子片段克隆及报告载体构建

本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记.     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

猪皮下和内脏脂肪组织中G蛋白偶联受体120(GPR120)第2内含子CpG岛甲基化促进其mRNA的转录

G蛋白偶联受体120(G-protein coupled receptor 120,GPR120)是脂肪组织中唯一高表达的一种长链不饱和脂肪酸受体,参与多种生理过程。DNA甲基化大多数发生在CpG含量丰富的区域(CpG岛),是一种介导基因在组织间差异性表达的重要表观遗传学修饰。为了研究CpG岛甲基化对GPR120在猪皮下(背部皮下)和内脏(大网)脂肪组织中mRNA表达量的影响,本实验采用qRT-PCR检测了金华猪(Sus scrofa)(6月龄和7年)不同脂肪组织中GPR120 mRNA表达量。同时,利用在线预测软件分析了GPR120的DNA全序列(从第一外显子上游5 000 bp到最后一个外显子下游5 000 bp)的CpG岛分布,采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测了CpG岛在不同脂肪组织中的甲基化状态,并用亚硫酸氢钠修饰后测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)对Sequenom MassArray检测结果进行了验证。结果显示,在6月龄和7年两个时间点中,皮下组织中的脂肪体积都极显著高于大网的脂肪体积(P0.01),同时皮下组织中的GPR120表达量极显著高于大网(P0.01),与脂肪体积大小趋势一致。生物信息学方法预测出GPR120的DNA序列GC含量丰富,共含有5个CpG岛,依次位于基因的不同元件:5'非编码区、第1外显子、第2内含子和3'非编码区。甲基化分析结果显示,在两个时间点中位于第2内含子的CpG岛甲基化在皮下组织中显著高于大网(P0.05),并BSP实验结果验证了组织间的甲基化差异,其余4个CpG岛甲基化水平在组织间差异均不显著。第2内含子的CpG岛甲基化与基因表达差异趋势一致。本实验提供了在不同组织间整个基因范围内的DNA甲基化模式,结果表明GPR120富含丰富的CpG岛,其中基因内的CpG岛甲基化与其mRNA表达量正相关。本研究为揭示GPR120在组织间差异表达的表观遗传调控提供了理论基础。     

入侵植物黄顶菊不同器官和不同发育阶段DNA表观遗传多样性变化特征

DNA甲基化是植物DNA普遍存在的一种表观遗传修饰方式,不仅在植物快速适应新环境中发挥重要的作用,还参与植物生长发育和器官分化特异性过程。本研究通过构建优化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)体系来分析入侵植物黄顶菊不同器官和同一器官不同发育阶段的组织甲基化变异特征。结果表明:器官特异性MSAP体系利用筛选的13对引物共扩增536条条带,其中引物EhHM7对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为92.45%;发育阶段特异性MSAP体系利用筛选的14对引物共扩增407条条带,其中EcHM1对表观遗传多样性贡献率最大,多态性百分比为80.56%。甲基化类型变异结果显示,黄顶菊不同器官(根、茎和叶)间以及同一器官不同发育阶段(老叶和嫩叶)的组织间均表现出显著的甲基化水平差异性,半甲基化、全甲基化和整体甲基化三种甲基化变异类型中茎组织的甲基化发生率最高,分别达到30.28%、19.37%甲基化率显著高于嫩叶组织,分别达到33.29%密集,且嫩叶较老叶密集,表明根个体间和茎个体间均存在较大的差异,这种个体差异大于黄顶菊叶片的个体间差异,且老叶的个体差异大于嫩叶,这种个体间差异在样品采集时不可忽视。所以,在利用表观遗传学方法进行黄顶菊入侵性的研究中,必须要制定科学的采样方案,把植物器官和生长发育阶段特异性作为一个重要因素考虑在内。     

Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632对猪诱导多能干细胞冻存和传代效率的影响

猪作为重要的疾病模型动物,目前猪诱导多能干细胞(iPS 细胞)已有建系,但是细胞的冻存和传代的效率较低,影响后续的实验研究。Rho 相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂 Y-27632 可提高人胚胎干细胞的解冻存活率,促进其克隆形成。本实验以猪(Sus scrofa)iPS 细胞为研究对象,通过在猪 iPS 细胞冻存和解冻过程中添加Y-27632,发现其可以减少猪 iPS 细胞在冻存和解冻复苏过程中的凋亡。在细胞的传代过程中,使用 Y-27632 可以促进猪 iPS 细胞的贴壁和克隆形成。虽然高浓度 Y-27632 会对猪 iPS 克隆的形态产生一定的影响,但并未影响细胞的碱性磷酸酶(AP)活性和多能性基因 Oct4、Sox2 和 Nanog 的表达水平。最后将转座子报告质粒 PB[Act-RFP]DS 导入猪 iPS 细胞中,经流式筛选后得到的带有红色荧光的细胞,并将其注射于猪孤雌胚胎中进行发育能力检测,发现 Y-27632 的处理能减少细胞在流式筛选和胚胎注射中的凋亡,促进其在胚胎内的嵌合发育。研究结果说明,ROCK 抑制剂 Y-27632 可以提高猪 iPS 细胞冻存和传代的效率,促进其在胚胎中的嵌合。该研究有助于猪 iPS 细胞及其他多能干细胞的保存,传代和筛选等相关研究。     

RG108对猪胎儿成纤维细胞甲基化水平及克隆胚胎发育的影响

本研究使用RG108处理猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblast,PFF),研究其对细胞甲基化水平和核移植效率的影响。使用0.05、0.5、5和50μmol·L-1RG108分别处理细胞24、48和72 h后,用高效液相色谱和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法分析细胞整体甲基化水平和印迹基因H19和IGF2R的DMR区甲基化率,并检测RG108处理对细胞生长、凋亡、染色体变化及随后的核移植效率的影响。整体甲基化水平结果通过两因素方差分析,发现RG108处理浓度与处理时间无交互作用,处理浓度间细胞甲基化水平差异不显著,但处理时间却能显著的影响甲基化水平,且50μmol·L-1RG108处理细胞72 h后整体甲基化水平显著低于对照组。BSP分析结果表明,5和50μmol·L-1处理PFF 72 h后H19的DMR区域甲基化率显著降低。RG108对细胞生长有一定的抑制作用,且0.5、5和50μmol·L-1组经处理72 h后凋亡比例显著提高,但对细胞的染色体数目没有显著影响。PFF经5和50μmol·L-1RG108处理72 h后能显著提高卵裂率和囊胚细胞数,且5μmol·L-1组囊胚率也显著提高。结果表明,RG108降低细胞整体甲基化水平呈时间依赖性,且同时降低H19的DMR区域甲基化率。PFF经5μmol·L-1浓度处理72 h组能显著提高核移植胚胎效率。     

家畜多能干细胞的研究现状与应用

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括从胚胎内细胞团中分离出的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),外胚层干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs),从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs).这些细胞都具有向各种类型细胞发育的潜能,因此,PSCs为再生医学的发展,人类基因疾病的动物模型的建立,异种器官移植和高质量抗病新品种的培育提供了有效的途径.迄今为止,PSCs在小鼠(Mus musculus)模型和人类物种已经做了大量研究,同时,家畜的ESCs和iPSCs也取得了有效的进展,表明其不仅可以应用于特定家畜优良品性的稳定遗传和优育,而且可以以家畜为载体生产人类需要的化学药品和抗体,甚至应用在人类疾病的临床前应用中.然而,家畜的ESCs相对来说是难分离和富集的,体外培养建立稳定的ESCs系具有更大的难度和挑战.近年来,得益于对家畜ESCs和相关iPSCs相关的持续研究,已初步揭示了家畜ESCs的独特生物学特性.PSCs已经成为生命科学和高科技农业和生物学一个创新的研究领域.在本文中,本文综述了家畜PSCs的发展历程与应用前景.     

大家畜诱导多潜能干细胞(iPSCs)研究进展

向分化的体细胞内导入特定的诱导因子,可将其重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),iPSCs同胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)一样具有自我更新并维持未分化状态的能力。iPSCs的出现,有效地解决了ESCs研究领域存在的伦理道德限制和免疫排斥问题。自2006年国际上首次成功获得小鼠(Mus musculus)诱导多潜能干细胞以来,iPSCs研究发展迅猛。从利用病毒载体到普通质粒载体,从导入DNA、RNA和蛋白质,再到利用小分子化合物组合进行体细胞重编程,iPSCs诱导技术正在向多元化发展;同时,研究者们对细胞重编程机理的认识也在加深。与此同时,大家畜iPSCs研究领域也相继获得了猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)和绵羊(Ovis aries)等动物的iPSCs,并得到了iPSCs嵌合猪和iPSCs嵌合羊。由于猪等大家畜不仅在解剖和生理结构等方面与人相似,还是人类(Homo sapiens)最主要的肉类和奶类等食物来源,关系着人类的健康,因此大家畜iPSCs在临床应用和生产实践上具有重大价值。鉴于此,本文对iPSCs诱导方法、效率、机制和大家畜iPSCs研究现状做一综述。     

优化的小鼠STO细胞系重编程多功能干细胞的建立

研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系.     

重金属镉胁迫下入侵植物黄顶菊表观遗传变异特征

为探究入侵植物黄顶菊在重金属镉(Cd)胁迫下耐受性获得的表观遗传机制,本研究通过网室盆栽试验模拟不同浓度Cd污染生境,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对不同Cd浓度胁迫[0(CK)、2(Cd-1)、4(Cd-2)和8(Cd-3) mg·kg^-1]处理植物叶片基因组DNA甲基化变异特征进行分析。结果表明,15对引物共扩增出726条甲基化条带,且引物多态性百分比为84.75%;随着Cd胁迫浓度的升高,黄顶菊叶片全甲基化和整体甲基化发生比例呈逐渐增加的趋势,Cd-1、Cd-2和Cd-3的全甲基化发生比例分别为CK的1.51、1.95和2.11倍,整体甲基化发生比例分别较CK升高了39.28、53.30和63.97个百分点;不同处理下叶片甲基化状态变化分析结果表明,Cd胁迫下黄顶菊基因组DNA重新甲基化和去甲基化2种甲基化模式均有发生,但以重新甲基化类型为主要变化模式;Cd胁迫下植物表型可塑性与表观遗传相关性分析结果表明,DNA全甲基化和整体甲基化水平与黄顶菊生长指标及地上部耐受性指数的表型可塑性呈显著负相关,与抗氧化酶活性、各组织Cd含量及富集与转移系数呈显著正相关。本研究结果从表观遗传学方向为入侵植物黄顶菊的防控提供了新思路。     

DNA甲基化与细胞分化

DNA甲基化与DNA遗传信息的传递及组织特异性基因的正确表达存在着十分密切的关系。DNA甲基化受组蛋白H 3和DNA甲基化转移酶的调控;甲基化的DNA与许多的蛋白质共同相互作用,调控基因转录,从而导致基因印迹和基因沉默,使细胞向特定方向分化。本文重点综述了DNA甲基化位点、甲基化转移酶及DNA甲基化相关的蛋白质;DNA甲基化与基因印记、基因沉默的关系及其对细胞分化的影响。     

乙烯利处理对棉花子叶DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片早衰影响棉花产量和棉纤维质量,而乙烯利是一种重要的植物生长调节剂,对促进植物组织衰老有重要作用。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在高等植物的基因表达调控中发挥了重要作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,探讨在不同乙烯利水平处理下,棉花子叶DNA甲基化水平和甲基化变化模式。结果显示,经300、500和700 mg/L乙烯利处理后,棉花子叶DNA甲基化比值分别为32.99%、35.45%和37.49%,都低于对照组(37.92%);和对照组相比,经不同浓度乙烯利处理后,棉花子叶DNA发生甲基化变化位点的比率分别是2.71%、3.63%和4.88%,而去甲基化位点的比率分别为10.66%、9.84%和9.23%,并且随着乙烯利浓度的增加,棉花子叶DNA甲基化位点与去甲基化位点之比逐渐提高;本研究鉴定了17个MSAP差异基因片段,这些片段与NCBI中已知的功能基因存在同源性,包括果胶甲酯酶基因、细胞色素P450、乙醇脱氢酶基因、肌动蛋白解聚因子、翻译延伸因子等和乙烯利诱导棉花子叶衰老相关基因。研究结果提示,在乙烯诱导棉花子叶衰老的进程中,DNA甲基化参与了棉花子叶衰老的调控,为从基因组水平上揭示乙烯诱导棉花衰老的调控机制提供理论依据。     

填饲对朗德鹅SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化和mRNA表达的影响

DNA甲基化是表观遗传学的研究热点之一.为了探索填饲是否能够引起朗德鹅Anser anser)肝脏脂类代谢中DNA甲基化水平以及基因表达量的变化和DNA甲基化修饰作用和基因表达之间的关系.本研究运用焦磷酸测序技术分析鹅肝脏硬脂酞辅酶A去饱和酶5基因(stearovl-CoA desaturase 5,SCD5)、固醇调节元件结合蛋白2基因(sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2)和超长链脂肪酸延伸酶6基因(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)的甲基化水平,再运用qRT-PCR技术进行定量验证.结果显示,SCD5、SREBP2和ELOVL6各2个片段的甲基化水平均在20％以上,均属于高甲基化状态;对照组3个基因各2个片段的甲基化水平均高于填饲组,填饲组与对照组的SCD5-1S和SREBP2-1S片段甲基化差异显著(P＜0.05),SREBP2-2S片段甲基化差异极显著(P＜0.01),SCD5-2S、ELOVL6-1S和ELOLV6-2S片段甲基化差异不显著(P＞0.05);填饲组SCD5和ELOVL6的mRNA表达量均高于对照组,而SREBP2在填饲组的mRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05).综合各项指标,填饲引起鹅肝脏组织SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化水平降低,SCD5和ELOVL6 mRNA表达量上升,SREBP2的mRNA表达量降低,表明SCD5和ELOVL6的甲基化修饰对mRNA的表达起反向调控的作用.本实验结果为表观遗传学上DNA甲基化研究方法提供参考,为选育鹅肥肝高产高质系提供重要的分子遗传学依据,也为人类肥胖症和脂肪肝等代谢疾病的研究提供理论依据.     

牛卵母细胞对成纤维细胞重编程作用

转录因子nanog和oct-4是细胞具有多潜能性的关键调控因子,一般认为它们的表达是细胞具有多潜能性和自我更新能力的标志.本研究将牛成纤维细胞(BEF422)分别移入GV期和MⅡ期卵母细胞,体外培养24 h后,RT-PCR检测其nanog和oct-4基因的表达情况,并用免疫荧光染色法对这两个基因在移植卵中的分布进行定位.结果表明,牛成纤维细胞移植入GV期和MⅡ期卵母细胞培养后,nanog和oct-4基因均被诱导表达,并且明显定位于移植细胞的细胞核上,而成纤维细胞组和未注射成纤维细胞的空白卵母细胞组中均未检测到nanog和oct-4的表达.说明GV期和MⅡ期卵母细胞均能激活成纤维细胞中转录因子nanog和oct-4的表达,使其发生重编程.本研究选取GV期和MⅡ期这两个关键时期的卵母细胞为研究对象,为进一步解释卵母细胞中含有的与供体细胞重编程相关的物质及作用机理提供了一定的基础资料.