猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立

猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSu V)是一种无囊膜,单链的DNA病毒,存在猪细环病毒1型和猪细环病毒2型2个亚型。为建立一种新型快速的TTSu V1检测方法。针对TTSu V1保守的非编码区域(untranslated regions,UTR)设计2对LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行了优化调整,建立了TTSu V1 LAMP检测方法。结果表明该方法最佳反应条件为62℃1 h,病毒最低检出限可达9.2 copies/μL,特异性良好。LAMP反应是一种集特异性强,灵敏度高,反应速度快于一体的的基因检测方法,有望成为快速检测TTSu V1的手段之一。     

检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法的建立及初步应用

根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。     

棉花皱叶病毒LAMP检测方法的建立

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同属的CLCrV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)及番茄黄化曲叶病毒(TYLCV);灵敏度高,可检测到约43fg/μL的总DNA,比普通PCR灵敏度高1 000倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应进行结果判断。该方法适用于现场CLCrV的快速检测。     

鹅细小病毒LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的鹅细小病毒(GPV)VP3基因序列,利用PrimerExplorer V3软件在序列保守区域没计1套特异识别VP3基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的GPV检测方法.结果表明,该方法灵敏度是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增GP...     

副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,该法在55℃水浴1h即可对副猪嗜血杆菌核酸进行高效扩增,反应结束后加入SYBR GreenⅠ即可通过肉眼观察对结果进行判断。该方法具有很强的特异性,其对DNA核酸的最低检测限为40fg,是常规PCR检测最低限的100倍,显示出较高的敏感性;用建立的LAMP方法对8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测,结果均为阳性。用建立的LAMP方法对10种体液进行检测,结果鼻液、气管液、胸腔渗出物、心脏血、脑膜液、腹腔液和关节囊液呈阳性,唾液、心包液和尿液呈阴性。【结论】建立了一种可对副猪嗜血杆菌进行快速检测并可凭肉眼判定结果的可视化LAMP方法,该法操作简便、反应快速、敏感性强、特异性高,适合在兽医基层进行推广应用。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为967%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。     

猪圆环病毒PCR实验报告研讨

根据猪圆环病毒2型（PCV-2）01KF1基因序列,设计并合成了一对特异性引物,以PCV-2为模板,建立了检测PCV-2的PCR方法。用本方法对猪细小病毒（PPV）,猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRR-SV）及PK-15细胞进行同条件检测．均未有条带出现,结果均为阴性。表明该方法具有良好的特异性：敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为4．2pg;对保定、安新、定州、正定送检的四份临床样品进行检测。检测结果表明,四份临床样品均呈阳性。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中PCV2和PCV1的基因组序列设计3条引物,并建立了检测PCV2的复合PCR方法。用该方法对河南省7个地市45个猪场的156份样品进行了检测,检出阳性病料98份,阳性率63%;阳性猪场38个,阳性率84%,表明该方法特异性及敏感性高,可用于临床诊断。     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速、敏感、特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中町最低扩增到0.1 ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV、PPV不能检出.可对病料、血清提取DNA进行检测,所有程序在5 h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.     

猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染的检测

为诊断中牟某猪场送检病料的感染类型,调查了其流行病学、临床症状和病理剖检特征,并采用PCR检测技术对其进行检测。结果表明,该猪场存在猪细环病毒与猪圆环病毒2型的混合感染。     

猪圆环病毒Ⅱ型核酸诊断方法的建立和初步应用

根据Genebank上已发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)序列设计1对引物PL1/PL2,通过对反应条件的优化,建立了有效的猪圆环病毒Ⅱ型的PCR诊断方法,并对沪郊1株PCV-2分离毒进行了检测和测序鉴定,结果显示此株分离毒为PCV-2病毒。结果显示:新建立的PCV-2的PCR诊断方法具有快速、准确等优点。     

鲨鱼弧菌LAMP检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(LAMP)成功构建了一种鲨鱼弧菌的检测方法。根据鲨鱼弧菌的rpoA基因序列设计4条引物(内引物F3和B3,外引物FIP和BIP),并对LAMP扩增反应的各物质浓度和反应条件进行优化,确定最佳反应温度为65°C,最佳反应时间为55 min。该法对鲨鱼弧菌纯菌培养物的检测浓度约为2.4×102CFU/mL,结果比PCR法具有相似或更高的灵敏度,而且操作简单,反应后体系变浑浊,肉眼可辨;加入SRYB Gold荧光染料,阳性反应为绿色,阴性对照为浅橘色,更便于观察,有望发展成为快速检测鲨鱼弧菌的一种有效方法。     

水环境中诺如病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

[目的]基于诺如病毒(NV)基因保守区,设计一套RT-LAMP简并引物,建立能简便、特异、灵敏检测水环境样品中NV的一步法RT-LAMP技术。[方法]通过试验,优化反应温度(64℃)、反应时间(40 min)、Mg2+浓度(2 mmol/L)等参数,建立反应体系。[结果]该方法只需1台水浴锅在1 h内即可完成检测,可直接用肉眼观察结果,检测灵敏度比普通RT-PCR高100倍;简并引物的设计增强了特异性,可检测多个血清型的NV。[结论]在样品检测中,RT-LAMP技术的灵敏度达97.7%,高于RT-PCR的90.7%,更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测。     

检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用

为了进一步调查研究PVC2的流行病学及其致病机制,根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,对来自广东、广西、湖南、海南等地287个猪场送检的1 560个可疑病料进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆、酶切、测序鉴定,建立了PCV2检测的套式PCR方法.结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上.该PCR方法对PCV2是特异的,并具有良好的重复性和稳定性.用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,表明该病在我国广泛流行.     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便...