超表达OsPR1A增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性反应

【背景】前期研究发现,水稻病程相关蛋白质OsPR1A的表达受上游抗病基因Xa21调控,接菌后早期启动Xa21介导的OsPR1A较高水平表达对水稻抵抗白叶枯病菌至关重要。同时OsPR1A也受到水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）的诱导表达。对于OsPR1A的研究绝大部分是作为抗性反应发生的标志基因佐证其他基因或途径在抗性中的作用,缺乏直接的证据证实OsPR1A本身的生物学功能。【目的】通过获得OsPR1a-OX超表达转基因植株,调查其表型及农艺性状,并明确OsPR1A蛋白质表达与抗性的关系,为鉴定OsPR1A功能提供依据。【方法】通过农杆菌介导法,将构建的OsPR1a-OX转化载体转入到水稻受体4021中,利用PCR和免疫印迹（western blot,WB）技术分别在基因水平和蛋白质水平上筛选并鉴定OsPR1A超表达阳性纯合株系。在成熟期,调查OsPR1A超表达转基因植株的表型及农艺性状（株高、穗长、分蘖数、结实率和籽粒大小等）。在31℃条件下,将生长2周的水稻幼苗TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株接种水稻白叶枯病菌,并在接菌0、2、4、6、8、10和12 d时测量病斑长度。在接菌0、4和6 d时,收集TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株的水稻叶片,提取蛋白质,利用WB技术检测OsPR1A的表达特征。【结果】构建了OsPR1a-OX转化载体,并转入到受体4021中,筛选并鉴定到2个OsPR1A超表达转基因纯合株系（#704和#709）。调查了OsPR1A超表达转基因植株在成熟期的表型及农艺性状,与对照4021相比,#704和#709的株高较矮、穗长较短、分蘖数减少、结实率降低,但籽粒稍大,可能与结实率低有关。在31℃条件下,OsPR1A超表达转基因植株的病斑长度与对照4021相比明显缩短,结果具有显著性差异（P<0.05）。在接菌0、4和6 d的材料中,超表达转基因植株#704和#709中OsPR1A始终有较高水平的表达丰度,从而提高了对白叶枯病菌的抗性。【结论】采用农杆菌介导法,获得OsPR1A超表达转基因植株;超表达OsPR1A影响到水稻的正常发育过程;超表达OsPR1A后增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性。     

转拟南芥NPR1基因水稻253 T3代株系对水稻

【目的】获得高抗水平的转拟南芥NPR1恢复系水稻253株系,比较转基因水稻与其非转基因野生型抗病性和农艺性状的差异,以期为转基因抗病育种提供材料。【方法】以通过连续自交获得的转AtNPR1基因253 T3代纯合株系和非转基因253为材料,于分蘖期采用剪叶法接种白叶枯病菌菌株13751于水稻叶片,14 d 后,对稻株发病情况进行调查;收获期考查6个转基因株系的农艺性状。【结果】6个转基因T3代株系植株的抗病性可稳定表达,其病斑长度均显著短于非转基因野生型253;253-3的抗病能力比野生型253增强50%以上,其他 5个株系253-4、253-7、165、166、167对水稻白叶枯病表现出高抗水平,抗病能力增强90%以上。与野生型253相比,转基因株系植株生长正常,不同株系间部分农艺性状无明显变化规律,而部分农艺性状显著升高或降低;株系166的株高、穗长、有效穗数、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等显著优于非转基因恢复系253。【结论】拟南芥NPR1基因可作为培育广谱抗病作物的热门候选基因,株系166可作为水稻抗病育种的新种质。     

Agronomic traits and rice bacterial blight disease resistance in T3 generation lines of rice cultivar 253 over-expressing Arabidopsis thaliana NPR1 gene

[目的]获得高抗水平的转拟南芥NPR1恢复系水稻253株系,比较转基因水稻与其非转基因野生型抗病性和农艺性状的差异,以期为转基因抗病育种提供材料.[方法]以通过连续自交获得的转AtNPR1基因253 T3代纯合株系和非转基因253为材料,于分蘖期采用剪叶法接种白叶枯病菌菌株13751于水稻叶片,14d后,对稻株发病情况进行调查;收获期考查6个转基因株系的农艺性状.[结果]6个转基因T3代株系植株的抗病性可稳定表达,其病斑长度均显著短于非转基因野生型253;253-3的抗病能力比野生型253增强50％以上,其他5个株系253-4、253-7、165、166、167对水稻白叶枯病表现出高抗水平,抗病能力增强90％以上.与野生型253相比,转基因株系植株生长正常,不同株系间部分农艺性状无明显变化规律,而部分农艺性状显著升高或降低;株系166的株高、穗长、有效穗数、一次枝梗数、每穗总粒数、每穗实粒数和单株产量等显著优于非转基因恢复系253.[结论]拟南芥NPR1基因可作为培育广谱抗病作物的热门候选基因,株系166可作为水稻抗病育种的新种质.     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

苋色藜NDR1基因抗病毒特性初步研究

以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。     

转NDR1基因烟草对赤星病和晚疫病的抗性增强

 NDR1(nonrace-specific disease resistance)基因在植物系统获得性抗性的信号传导途径中起着重要的作用,过量表达该基因的拟南芥对不同病原菌的抗性都有提高。利用PCR技术首次克隆了拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因,与Columbia生态型相比,该基因共有7处碱基不同,引起编码氨基酸变化4处。构建了植物高效表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经PCR和Southern鉴定,外源基因已整合到植物基因组中。随机挑选10个转基因株系进行抗病性分析,其中3个株系对赤星病和晚疫病的抗性明显增强。     

农杆菌介导的水稻转化及bar基因稳定遗传

以秀水11、072和ZH9905的胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法将抗除草剂基因bar导入水稻基因组，经PCR、Southern杂交分析获得大量转基因植株。除草剂喷洒试验表明，转基因水稻对除草剂Basta具有高度的抗性。对R1代植株分析表明外源基因已遗传给后代，部分株系的分离比率符合3：1。对部分转基因水稻植株考察结果表明，部分转基因植株的农艺性状与亲本相似，但育性下降。     

RNAi介导抗水稻条纹病毒转基因水稻的培育

本研究根据RNA干扰的机制原理,利用已构建的包含SP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pDTRSV-IRSP-Bar,通过采用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得抗条纹叶枯病和抗除草剂的转基因水稻植株,通过Basta抗性筛选、PCR检测及Northernblot分析,获得了稳定高抗RSV和抗Basta的株系KRSV1和KRSV9,并对其田间抗性及农艺性状表现进行了调查研究。     

干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响

利用已公布的水稻Cry1a与Cry1b基因序列设计引物,PCR扩增基因部分片段,构建了一个包含2个隐花色素基因片段的ihpRNA表达载体pSC1301-347-Cry1aCry1b,并通过农杆菌介导转化水稻,以期同时导致这2个基因功能缺失.根据转基因植株主要农艺性状的表现,初步分析了Cry1a与Cry1b对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期推迟16 d,株高增加明显,粒型显著变长,而其他所观察的性状无明显改变.     

Xα21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体，经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因Xα21导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系SWR20中，共获得43个独立的转基因株系，100余株转基因水稻植株，经GUS活性，潮霉素抗性检测及PCR分析表明，外源基因已整合到转基因水稻基因组中，白叶枯病原菌接种试验表明，大部分T0代转基因水稻植株的抗病性有明显提高，多数植株抗或高,抗，个别为感病，经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后，GUS瞬间表达率可高达 92．5％，稳定转化频率达到27．6％。α     

抗真菌转基因水稻对稻田靶标病害和非靶标病虫害的影响

【目的】评价抗真菌转基因水稻对靶标真菌病害的抗性和稻田非靶标病虫害发生的影响。【方法】以过表达水稻酸性几丁质酶基因（RAC22）和水稻碱性几丁质酶基因（RCH10）及转化苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因（β-Glu）和大麦核糖体失活蛋白基因（B-RIP）的四价抗真菌转基因水稻品系E122-1和E127-1以及对照非转基因亲本E32为材料,通过温室接种和田间调查开展E122-1和E127-1对稻瘟病、稻曲病和胡麻叶斑病等靶标真菌病害的抗性和对白叶枯病、细菌性条斑病、三化螟和稻纵卷叶螟等非靶标病虫害的影响。【结果】E122-1和E127-1对稻瘟病菌株的抗性比对照明显提高,同时,E122-1和E127-1田间发生稻曲病和胡麻叶斑病的带病株率和病情指数比对照显著降低,而两者田间发生白叶枯病和细菌性条斑病的感病株率和病情指数,发生三化螟的枯心株率和发生稻纵卷叶螟的卷叶株率与对照相比无显著差异。在抗白叶枯病的抗性植株中,E122-1和E127-1的0级植株数量显著高于对照,3级植株数量显著低于对照。【结论】E122-1和E127-1对稻瘟病、稻曲病和胡麻叶斑病具有较好的抗性水平,田间种植,相比对照,不会显著引发白叶枯病、细菌性条斑病、三化螟和稻纵卷叶螟等非靶标病虫害的上升。     

水稻品种Acc8558抗白叶枯病的抗性基因定位

以高抗白叶枯病水稻品种 Acc8558和高感品种 H359为亲本 ,采用单粒传方法建立一个重组自交系群体 ,利用该群体构建了一张包含 2 2 5个分子标记的连锁图 .1996、1997年对该群体连续 2 a进行了白叶枯病抗性鉴定 ,并对白叶枯病抗性基因进行了定位分析 .结果表明 ,白叶枯病的抗性由 1对主效基因控制 ,且存在一些微效的修饰基因 .该主效基因位于第 5号染色体的 R830与 P2 2 / M17- 4两标记之间 ,距 R830和 P2 2 / M17- 4的距离分别约为 4 .8c M和 6 .1c M     

水稻白叶枯病基因的作用机制与育种应用

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,水稻病害是其产量损失的重大威胁,由革兰氏阴性菌稻黄单胞杆菌所引起的白叶枯病是严重影响水稻产量的三大主要病害之一。传统的化学防治方法存在很多弊端,抗白叶枯病水稻品种的培育是世界公认防治该病害最为安全、有效的手段,抗病种质资源鉴定与抗性基因挖掘是抗病品种培育的前提。在自然和人工双重选择压力下,白叶枯病菌不断变异,陆续出现了新型致病变种,主栽品种逐渐失去抗病性,因此发掘和鉴定更多的持久抗病基因显得非常必要。对已克隆的 16 个白叶枯病抗性基因进行简要归类,并从基因的发现、定位、克隆、作用机制等方面对广谱抗白叶枯病且应用较好的 3 个基因Xa23、Xa7 和 xa5 进行详细阐述,对白叶枯病抗性育种方法分子标记辅助选择育种、转基因育种和基因标记育种进行介绍。此外,结合不同白叶枯病基因的自身特性及当前育种利用中存在的问题,展望白叶枯广谱抗病分子育种的未来方向。     

利用分子标记辅助选择育种(MAS)技术改良水稻恢复系粤恢826

[目的]改良杂交稻恢复系粤恢826,以提高其稻瘟病和白叶枯病抗性,改良米质,为选育抗病、优质的杂交稻组合提供良好亲本材料.[方法]以含稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2、白叶枯病抗病基因Xa23及蜡质基因Wx的中间材料Z1103为供体亲本,杂交水稻强恢复系粤恢826为受体亲本,利用分子标记辅助选择(MAS)技术和系谱选育方法,聚合4个外源基因以改良粤恢826的抗病性和米质,并进行稻瘟病和白叶枯病抗性及米质鉴定.[结果]经SSR分子标记检测、田间抗病性及米质鉴定,获得以粤恢826为遗传背景且含有目标基因的6个改良株系,通过农艺性状筛选与恢复力测试,优选到一个含有Pi1、Xa23和Wx基因的纯合株系,其恢复力好,农艺性状优良,2014年早造定名为粤恢88,其田间鉴定稻瘟病抗性3级,白叶枯病抗性1级,米质为软米.2014年晚造与两系不育系Y58S配制杂交稻组合Y两优88,其在品比试验中产量达6543 kg/ha,比对照深两优58香油占增产4.97%,未达显著水平(P>0.05),且抗稻瘟病,中抗白叶枯病,米质鉴定为国优3级和省优3级.[结论]MAS技术可有效聚合多基因(Pi1、Xa23和Wx基因),使粤恢826的稻瘟病和白叶枯病抗性及米质明显改良,获得抗稻瘟病、高抗白叶枯病、米质为软米的新恢复系粤恢88,为选育抗病优质的杂交稻组合提供良好亲本材料.     

无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育

 为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系，将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因（HPT）分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中，并经农杆菌介导，将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中，获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明，AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中，并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察，选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系；抗病性鉴定结果表明，转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高，部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。     

植物防御素基因alfAFP(M. sativa)在毕赤酵母中的分泌表达及对水稻病原菌的抑制

 【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母（GS115）,再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5 kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP在酵母中成功诱导表达,并对水稻测试病菌具有一定的抑制活性,预示着alfAFP防御素基因在水稻抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

转几丁质酶基因水稻抗纹枯病性及农艺性状遗传特性

[目的]揭示转基因水稻的纹枯病抗性及其非目标变异性状的遗传特性,为合理利用转基因水稻进行抗病育种提供理论指导.[方法]以海转A为父本、竹籼B为母本杂交,通过对杂交F1和F2代的抗病性状进行分析,揭示海转A的纹枯病抗性和部分非目标变异性状的遗传特性.[结果]转基因海转A除抗纹枯病性较非转基因亲本竹籼B有显著提高外,还存在穗粒数和千粒重两个非目标性状的变异,穗粒数较竹籼B增加44.2%,而千粒重降低12.1%.海转A的抗纹枯病性表现为存在主效基因的多基因数量遗传特性,而穗粒数和千粒重表现为典型的数量性状遗传;此外转基因海转A的抗病性、穗粒数和千粒重3个性状的变异系数均显著大于竹籼B,说明其稳定性较低.[结论]外源抗病基因的导入提高了水稻的抗病性,这种影响以主效基因的形式表达;而外源基因导入引起非目标性状的变异,但没有改变其原有的典型数量性状遗传特征.