异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

过表达胡杨PePKS5提高拟南芥耐盐性

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分,在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上,探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因,并在拟南芥中过表达,获得T₃代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型,测定其过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na⁺、K⁺动态离子流,利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na⁺和H₂O₂含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标,揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体,通过瞬时转化烟草,对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】(1)PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸,PePKS5氨基酸序列与...     

过表达胡杨PeRIN4基因拟南芥提高质膜H+-ATPase活性和耐盐性

本文克隆了RIN4(RPM1-interacting protein 4)在胡杨中的同源基因PeRIN4,并在拟南芥中进行过表达,通过研究转基因株系的耐盐表型、质膜H+-ATPsae活性及H+ 、Na+、K+等的动态离子流,揭示了PeRIN4基因在植物响应和适应盐胁迫环境中的作用。利用定位载体pGreen0029-PeRIN4-GFP瞬时转化拟南芥叶肉细胞原生质体的方法,对胡杨PeRIN4蛋白进行亚细胞定位,发现该蛋白定位在细胞的胞质中。耐盐表型实验结果显示,在100 mmol/L NaCl处理下,拟南芥PeRIN4过表达株系(OE1和OE8)的生存率和根长均明显高于野生型(WT)和转空载体拟南芥(VC),说明PeRIN4基因能够提高拟南芥的耐盐性。与WT和VC相比,拟南芥PeRIN4过表达株系质膜H+-ATPsae的活性较高。动态离子流数据显示,在盐胁迫下,PeRIN4过表达株系外排H+和Na+ 离子的能力强于野生型和转空载体拟南芥,然而K+的外流却弱于WT和VC。因此,PeRIN4蛋白具有调节质膜H+-ATPsae活性的功能。拟南芥质膜H+-ATPsae活性的提高主要有两方面的作用:一是可以增强H+泵的质子动力势,驱动Na+/H+逆向转运蛋白,提高Na+外排的能力;二是抑制质膜的去极化,减少K+离子通过去极化激活的外向型K+通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)外流,维持了K+/Na+平衡,从而提高PeRIN4转基因拟南芥的耐盐性。      

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaA QP1属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫.构建植物表达载体pCAMBIA 1304-MaA QP1获得转基因拟南芥植株,GUS染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部.通过Southern blot检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验.与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力.     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaAQP1 属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫。构建植物表达载体pCAMBIA1304-MaAQP1获得转基因拟南芥植株,GUS 染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部。通过Southern blot 检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验。与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力。     

胡杨PeREM1.3过表达提高烟草耐盐性的机制

目的盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1.3的编码基因PeREM1.3,并研究PeREM1.3基因在植物耐盐性中的作用。方法笔者将基因构件35S::PeREM1.3转入模式植物烟草中, 在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1.3的转基因烟草进行基因功能的分析。结果研究显示PeREM1.3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1.3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1.3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1.3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1.3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAK、NHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K+/Na+平衡。结论这些结果说明PeREM1.3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K+/Na+平衡来提高植物的耐盐性。      

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444b和peu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。      

胡杨PeREM6.5调控拟南芥水分胁迫耐受机制

【目的】Remorin蛋白是广泛存在于苔藓、裸子和被子植物中的蛋白家族,在调控植物生长发育及生物胁迫反应方面具有重要作用,但有关remorin抵御非生物胁迫作用机制的研究较少。前期研究发现抗逆树种胡杨的remorin 6.5(REM6.5)可通过增强质膜质子泵活性提高植物耐盐性,在此基础上,本文研究了胡杨PeREM6.5在植物耐受水分胁迫中的作用,旨在进一步揭示植物抗旱的生理与分子机制。【方法】以过表达PeREM6.5拟南芥（OE1和OE2）、野生型（WT）和转空载体对照（VC）拟南芥为试验材料,对各基因型拟南芥进行水分胁迫处理（包括渗透胁迫和土壤干旱）以及复水处理,从生理生化及分子生物学角度研究了胡杨PeREM6.5在拟南芥干旱胁迫中的响应机制。【结果】甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥的存活率、根长显著高于WT和VC,并且在渗透胁迫下细胞膜受损程度较小,这些表型差异主要与转基因拟南芥水分吸收、抗氧化防御能力增强有关。甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥水通道基因AtPIP1;2和AtPIP2;1的表达量提高。甘露醇处理诱导WT和VC根细胞积累H2O2,对细胞膜造成氧化...     

超量表达胡杨peu-MIR156j基因增强拟南芥耐盐性

Micro RNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码小分子RNA。本文克隆了miR156j的前体（peu-MIR156j）,并将其转入拟南芥获得35S：MIR156j转基因植株。对转基因植株的鉴定表明,过量表达miR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟。这一结果表明：同拟南芥、水稻等物种类似,胡...     

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P＜0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H₂O₂的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。      

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

利用花序浸泡法将大片段胡杨基因转入拟南芥

本研究以拟南芥为研究材料,采用花絮浸泡法转化了400个农杆菌株系,对该转化体系进行了研究.结果表明,共120个农杆菌菌系转化成功,获得阳性转化子,转化体系中,应用YEP培养基培养农杆菌活化效果好,应用0.05％浓度的silwet L-77,浸染40s,浸染三次可提高转化效率.本研究摸索出更适合的转化体系,对于本项目具有重要的应用意义,时于未来以拟南芥为受体进行胡杨大片段DNA转化,构建拟南芥转化子库奠定研究基础.     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)分别转化野生型拟南芥(Col-0),进行亚细胞定位观察,结果显示PeNAC045-GFP融合蛋白定位于细胞核上,并由DAPI进行核染色标定。利用农杆菌花序侵染法将构建的表达载体pCAMBIA1301-PeNAC045转化野生型拟南芥和突变体(ataf2),通过PCR鉴定,获得过表达植株及ataf2/PeNAC045回补株系。对各株系进行NaCl胁迫处理,分析PeNAC045基因的生物学功能。在150 mmol/L NaCl胁迫下,相比于拟南芥突变体和野生型植株,拟南芥PeNAC045过表达株系的萌发率降低,根长变短。此外,拟南芥PeNAC045过表达株系的株高明显低于其他株系,其在苗期对盐胁迫的敏感性增加。研究结果表明,在盐胁迫下,PeNAC045作为转录调节因子,负调控胁迫相关基因的表达。      

拟南芥PTR3基因过表达载体构建及转基因植株的获得

[目的]构建PTR3基因的过表达载体,并建立PTR3基因过表达植株,为进一步研究PTR3基因在调控重金属胁迫应答中的功能提供理论依据。[方法]提取野生型拟南芥总mRNA,并以反转录的c DNA为模板扩增出PTR3基因CDS全长,通过限制性核酸内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接,将该基因连接到带有35S启动子的p BI121载体上。[结果]将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株,通过浸花法将重组载体转化到野生型植株中,通过抗性筛选和遗传鉴定获得纯合的PTR3转基因阳性植株。[结论]PTR3过表达载体构建成功并获得转基因阳性植株,为研究PTR3基因的分子功能奠定基础。     

胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥;转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥,而Na+含量较野生型拟南芥低。100mmol/L NaCl处理后,转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2,并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响,用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI(抑制H2O2的产生)处理后,转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱,Na+外流和H+内流增强,植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生,维持了SOS1mRNA的稳定性,调控了K+和Na+平衡,并激活了抗氧化防御系统,因而显著提高了其耐盐性。     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达

为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。     

蚕豆VfGASA1基因的异源过表达延迟拟南芥开花

GASA(Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis)蛋白是一类受赤霉素调控的小分子蛋白质,参与植物生长发育的多条途径.本研究在蚕豆(Vicia faba)中同源克隆了VfGASA1基因,该基因的开放阅读框全长为363 bp,编码1个包含120个氨基酸残基的蛋白质,VfGASA...