奶牛皱胃平滑肌细胞体外培养方法的建立

平滑肌细胞是胃动力的基本单位,为研究奶牛皱胃弛缓的发病机理,本研究建立了奶牛皱胃平滑肌细胞的体外培养方法。手术取奶牛皱胃组织,镜下分离出肌层,运用酶消化法分离皱胃平滑肌细胞并进行体外培养,在倒置显微镜下观察细胞的生长状态,用免疫组化染色方法进行平滑肌细胞鉴定。结果显示细胞生长状态良好,呈现平滑肌细胞特征性的"峰-谷"状结构,免疫组化染色显示细胞浆内平滑肌肌动蛋白呈阳性表达,表明该细胞为平滑肌细胞,可用于后续的试验研究。     

山羊皱胃平滑肌细胞的培养及鉴定

用外科手术方法取山羊皱胃的平滑肌组织,采用组织块培养的方法,在体外进行山羊皱胃平滑肌细胞的分离培养,为反刍动物皱胃疾病的研究提供了实验材料。结果表明,本研究成功培养出山羊皱胃的平滑肌细胞。倒置显微镜下,细胞生长状态良好,呈现平滑肌细胞特征性的"峰-谷"状结构,活细胞达95%以上,免疫组化染色显示细胞浆内平滑肌肌动蛋白呈阳性表达。     

组织贴块法培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞

建立组织贴块法培养原代和传代肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC).将1～10日龄雏鸡的肺动脉中膜切成小于1 mm2的组织块,用翻转干贴壁法进行贴块培养.采用形态学和抗α肌动蛋白抗体(α-actin)免疫组化染色法对所培养的细胞进行鉴定.倒置显微镜观察培养的细胞呈梭形,重叠生长,呈典型的"峰-谷"状.抗α-actin单克隆抗体免疫组化染色可见胞浆内有明显的细丝,呈现棕黄色,表明所培养的细胞为肺动脉平滑肌细胞.组织贴块法简便易行,可用于血管病理生理变化研究.     

酶消化法分离培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞

试验旨在探讨胶原酶消化法分离并培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(pul monary artery smooth muscle cell,PASMC)的方法。将1～7日龄雏鸡的肺动脉中膜剪成小于1 mm2的组织块,0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离PASMC并进行原代培养和传代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的形态,对培养细胞进行HE染色和光学显微镜观察,并采用抗α-肌动蛋白单克隆抗体(α-Smooth muscle actin)免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白的表达,用以鉴定所培养的细胞。结果表明,倒置显微镜下细胞为长梭形,呈典型的"峰—谷"状,未见明显异型细胞。α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的97%以上。因此,胶原酶消化法可用于分离培养肉鸡PASMC,且有方法简单,成活细胞数多、传代周期短的特点,可用于肉鸡心血管疾病如肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

酶消化组织块法体外培养奶牛乳腺上皮细胞

建立稳定培养奶牛乳腺上皮细胞系的方法。结合酶消化法和组织块法,在体外进行分离培养奶牛乳腺上皮细胞,利用胰酶消化进行纯化和传代。通过倒置显微镜观察、细胞爬片姬姆萨染色和角蛋白18免疫组织化学方法对培养的细胞进行形态学观察和鉴定。观察发现,细胞排列紧密,呈多角形或梭形,长满后呈铺路石样。胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3~5个。通过细胞角蛋白18免疫组织化学方法对乳腺上皮细胞进行鉴定,呈阳性反应。获得的乳腺上皮细胞增殖旺盛,培养至40代生长活性仍然稳定。酶消化组织块法成功培养出奶牛乳腺上皮细胞,是分离乳腺上皮细胞的一种有效方法。     

牦牛皱胃组织结构及黏膜免疫相关细胞研究

为揭示牦牛皱胃组织结构和黏膜免疫相关细胞的分布与数量变化的规律,采用组织化学法、图像分析法及透射电镜技术,对牦牛皱胃组织结构及上皮内淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞变化进行了研究.结果表明:牦牛皱胃胃壁由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜构成.皱胃幽门腺区胃小凹深度最深、腺体最长、肌层最厚;3个腺区肌层厚度、腺体长度之间差异极显著(P＜0.01);幽门腺区与胃底腺区、贲门腺区之间胃小凹差异极显著(P＜0.01),胃底腺区与贲门腺区之间差异不显著(P＞0.05).牦牛皱胃黏膜上皮内淋巴细胞数量和浆细胞数量,3个腺区之间差异不显著(P＞0.05);肥大细胞数量以胃底腺区最多,幽门腺区最少,两者之间差异极显著(P＜0.01),贲门腺区与胃底腺区和幽门腺区之间差异不显著(P＞0.05).皱胃各腺区固有层中均有大量的弥散淋巴细胞和孤立淋巴小结.电镜观察表明,胃小凹柱状上皮细胞排列紧密.幽门腺区固有层中有大量的黏液细胞,黏液细胞呈高柱状或锥体状,核位于基底部,在细胞顶端常聚集有较多的电子密度较高的颗粒.胃底腺区和贲门腺区有大量的壁细胞和主细胞.牦牛皱胃的组织结构和其他反刍动物基本相似,但各层有其明显特点.牦牛皱胃各腺区固有层中均有大量弥散淋巴细胞和孤立淋巴小结,使牦牛皱胃具有比其他反刍动物更强的黏膜免疫功能.     

β-HB对牛皱胃平滑肌细胞活性影响——MTT法和CCK-8法的比较研究

以牛皱胃平滑肌细胞为研究对象,采用MTT法和CCK-8法检测添加不同浓度β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,β-HB)对牛皱胃平滑肌细胞活性的影响.通过接种不同的细胞密度((0.2、0.5、1、2、3)×105个/mL),加入MTT/ CCK-8孵育后,在不同的波长下读取D值并进行分析.确定CCK-8法的最佳检测波长为450 nm,最佳细胞浓度为1×10 5个/mL,最佳检测时间为4 h;MTT法的最佳检测波长为490 nm,最佳细胞浓度为3×105个/mL.在检测β羟丁酸对牛皱胃平滑肌细胞活性的影响时,2种方法的结果对比发现CCK-8法的数据偏差小,准确性高,灵敏,优于MTT法.     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养

本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。     

鲤鱼鳍条细胞的原代培养

通过对鲤鱼鳍条细胞进行原代培养,摸索出最佳的培养条件。采用组织块培养法,取一小块鳍条组织在不同培养基、温度、pH、CO₂等培养条件下进行培养,对其生长状况进行观察。培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕,培养1周可形成单层细胞,主要由上皮样细胞和少量成纤维样细胞组成。本研究初步确立了鲤鱼的鳍条细胞培养条件为:培养基为M199,培养温度为25~27 ℃,pH为7.2~7.6,CO₂浓度为5%,原代培养血清浓度为15%~20%,连续培养12 d后可得到纯化的鳍条细胞。     

孕酮、雌二醇对奶牛离体真胃平滑肌收缩的影响

随着奶牛集约化饲养规模的扩大和产奶量的提高,奶牛真胃变位(DA)的发病率逐渐增加.研究表明,DA多发生在奶牛围产期,而围产期母牛体内雌二醇和孕酮含量改变明显.本试验进行了不同浓度的孕酮、雌二醇对离体真胃平滑肌收缩影响的研究,表明0.4～12.8 μg/L的孕酮能使真胃平滑肌收缩强度显著降低(P＜0.01),且呈剂量-效应关系.50.0 ng/L～101.2 μg/L的雌二醇能显著抑制真胃平滑肌的收缩强度(P＜0.01),但不呈现剂量效应关系.     

氟西汀和5-羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

为探讨5-羟色胺转载体(5-HTT)在肉鸡肺动脉高压综合征发病中的机制,采用MTT比色法、流式细胞术及Hoechst33258荧光染色法研究5-羟色胺(5-HT)和5-HTT抑制剂氟西汀对体外培养的肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖与凋亡的影响,发现氟西汀能够抑制5-HT促PASMC增殖的作用;氟西汀能明显促进PASMC的凋亡,但氟西汀和5-HT共同作用于细胞,PASMC凋亡率明显少于氟西汀单独处理组。表明5-HTT在调节肉鸡PASMC的增殖和凋亡方面起重要作用,有可能参与肺动脉高压肉鸡肺血管重构的形成。     

肺炎支原体对大鼠气管平滑肌细胞损害作用的研究

采用贴片法进行大鼠气管平滑肌细胞的培养，将不同稀释度的肺炎支原体培养液接种于单层细胞中孵育。对次日收集的细胞上清液进行肺炎支原体的PCR反应检测，结果为阳性，而冲洗液反应阴性，表明支原体对细胞具有较强的粘附性；接种后7d内观察到细胞产生明显病变，部分细胞发生崩解、脱落。MTT法检测结果表明支原体使细胞活性明显降低，其致细胞死亡率随滴度增高而增加，提示肺炎支原体对大鼠气管平滑肌可产生很强的致病性，使呼吸道受到严重损伤。本研究为探讨肺炎支原体致病作用机制及新药筛选与评价提供一种新的方法。     

用十二指肠灌注法研究蛋氨酸和赖氨酸在泌乳奶牛限制性氨基酸中的顺序

选用装有瘘管的试验动物4头,采用4×4拉丁方试验设计。日粮精粗比为30∶70,在十二指肠分别连续灌注赖氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和蛋氨酸的混合物及10种必需氨基酸,通过对尿素氮、血浆氨基酸浓度变化的分析,研究赖氨酸、蛋氨酸的限制性顺序。试验结果表明,在此日粮水平下,蛋氨酸为第一限制性氨基酸,赖氨酸为第二限制性氨基酸。     

奶牛子宫内膜细胞体外培养及应用研究概况

子宫内膜细胞体外培养技术在研究动物子宫内膜生理功能、繁殖障碍疾病机制及治疗药物筛选等过程中具有重要的作用和意义。论文就国内外有关奶牛子宫内膜细胞体外培养技术中常用的分离、纯化和鉴定等方法以及该细胞体外模型相关应用进行综述,为探索简便、高效的奶牛子宫内膜细胞体外培养方法及国内有关奶牛子宫内膜生理病理的分子细胞学研究提供参考。     

新生猪肌组织成纤维细胞的分离培养和鉴定

研究建立了猪肌组织成纤维细胞体外培养的模型,采用组织块培养方法获得了新生猪肌组织成纤维细胞并进行体外培养.观察细胞形态,通过绘制细胞的生长曲线来研究肌组织成纤维细胞的生长规律,利用RT-PCR和免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定,再用双荧光素酶检测系统来检测细胞的转染效率.通过形态学观察、RT-PCR和免疫细胞化学染色结果表明,已成功培养了猪肌组织成纤维细胞,纯度达90%以上.     

Adipocytes suppress differentiation of muscle cells in a co‐culture system

The development of adipose tissue in skeletal muscle is important for improving meat quality. However, it is still unclear how adipocytes grow in the proximity of muscle fibers. We hypothesized that adipocytes would suppress muscle cell growth so as to grow dominantly within muscle. In this study, we investigated the effect of adipocytes on the differentiation of muscle cells in a co‐culture system. The fusion index of C2C12 myoblasts co‐cultured with 3T3‐L1 adipocytes was significantly lower than that of the control. The expression of myogenin and myosin heavy chain in C2C12 muscle cells co‐cultured with 3T3‐L1 adipocytes was significantly lower than in the control. Furthermore, the expression of Atrogin‐1 and MuRF‐1 was higher in C2C12 muscle cells co‐cultured with 3T3‐L1 adipocytes than the control. These results suggest that 3T3‐L1 adipocytes suppress the differentiation of C2C12 myoblasts. In addition, 3T3‐L1 adipocytes induced the expression and secretion of IL‐6 in C2C12 muscle cells. The fusion index and myotube diameter were higher in C2C12 muscle cells co‐cultured with 3T3‐L1 cells in medium containing IL‐6‐neutralizing antibody than the control. Taken together, there is a possibility that adipocyte‐induced IL‐6 expression in muscle cells could be involved in the inhibition of muscle cell differentiation via autocrine.     

牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法的建立

为了给牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法及进一步揭示肌肉分化的机理及转基因肉牛的研究提供重要帮助,试验以新生胎牛的骨骼肌为试验材料,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ与胰蛋白酶结合对其进行消化,并通过差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行分离纯化,同时采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western-blot法对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果表明:研究成功获得了大量的牛骨骼肌卫星细胞;该细胞的标志性分子的mRNA及其蛋白表达的纯度在98%以上;细胞生长状态良好,可稳定传至90代并保持旺盛的增殖活力;细胞分化效率高,2%的马血清能够诱导细胞分化使其融合形成多核肌管,数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管,并可观察到其具有收缩现象。     

奶牛乳腺肥大细胞免疫形态学的增龄性变化

应用改良甲苯胺蓝染色法研究不同年龄奶牛乳腺肥大细胞分布特点的增龄性变化，并用Alcian bluc-safranin染色法对肥大细胞进行细胞化学分型研究。结果：青年奶牛乳腺中肥大细胞数量较少，中年奶牛乳腺中肥大细胞的数量增多，有趣的是，老年奶牛乳腺肥大的数量更多，AB-S染色显示，各年龄奶牛乳腺中只有黏膜型肥大细胞。结果表明：奶牛乳腺肥大细胞数量具有随年龄增长而增加的特点，但肥大细胞的类型没有发生改变。     

奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及β酪蛋白mRNA的表达

本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。