山羊美丽筒线虫ITS序列的PCR扩增及分析

以神木山羊体内分离出的美丽筒线虫为研究对象,用保守引物进行PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8S序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定.结果获得一个美丽筒线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长均为1 035 bp.将序列与GenBankTM公布的相关序列进行比较分析,结果显示美丽筒线虫分离株ITS1与参考株的相似性为98.1％～99.7％,ITS2、5.8S序列与参考株相似性均达到100％.本研究是第一次从山羊体内获得美丽筒线虫ITS序列,为其分子学的进一步研究提供了基础资料.     

长颈鹿血矛线虫ITS的PCR扩增与序列分析

目的利用分子生物学方法对来自长颈鹿皱胃的血矛线虫进行虫种鉴定。方法对样品XM9和XM11的核糖体DNA内转录间隔区(ITS-1、5.8 S、ITS-2)进行PCR扩增及序列分析,并与GenBank公布的血矛线虫(Hae-monchus)相应序列进行比较。结果来自长颈鹿皱胃的2条血矛线虫具有相同的ITS序列,5.8 S与ITS-1分别为153 bp、404 bp,与GenBank分布的捻转血矛线虫序列是一致的。ITS-2序列为231 bp,第753位是一个多态位点,该序列与来自国外的H.contortus,H.placei,H.longistipes存在0-18个碱基差异。结论来自长颈鹿的血矛线虫是捻转血矛线虫。     

蛇四棘食道口线虫线粒体cox1 基因的克隆及序列分析

本研究旨在分析长沙市四棘食道口线虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)的遗传变异情况。应用聚合酶链反应(PCR)扩增四棘食道口线虫虫株的pcox1,应用Clustal X 1.83程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的MegAlign程序进行同源性分析,并与GenBank^TM中已知四棘食道口线虫相应基因序列进行比较分析。所得pcox1序列长度一致,均为393 bp,与GenBank公布的线虫相关序列进行比较分析结果表明,各个分离株与已知四棘食道口线虫相应基因的相似性分别在98%以上,与其它科线虫的相似性均小于91%。四棘食道口线虫pcox1序列种内相对保守,种间差异明显。本研究为进一步研究四棘食道口线虫的群体遗传学奠定了基础。     

黄鳝胃瘤线虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

本研究旨在阐明黄鳝胃瘤线虫湖南分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列的遗传变异情况,并用ITS序列重构胃瘤线虫与其它线虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增胃瘤线虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析.结果显示所获得的胃瘤线虫ITS及5.8 S rDNA序列总长存在一定差异(922～927 bp),其中包含部分的18S、28 S及全部的ITS-1 (350～351 bp)、5.8S(102 bp)及ITS-2 (340～344 bp)序列.本研究系国内首次报道胃瘤线虫的ITS序列,其结果为黄鳝胃瘤线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

鸡异刺线虫ITS rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析

应用PCR方法用保守引物NC5及NC2，扩增了从广州地区鸡体分离的鸡异刺线虫rDNA的第一、第二内转录间隔区（ITS-1，ITS-2）及5．8S基因。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM—TEasy载体。用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落进行测序。试验结果表明，ITS-1长为428bp，ITS-2长为386bp。通过与网上发表的来自澳大利亚的鸡异刺线虫基因序列比较结果表明。广州鸡体内的异刺线虫和澳大利亚鸡异刺线虫的ITS-2序列是完全一样的，ITS-1序列有微小差异，广州鸡的2个不同虫体样本的ITS序列完全一致。本项研究结果为鸡异刺线虫的进一步分子生物学研究奠定了基础，并为寄生虫分子系统学研究提供了资料。     

滇金丝猴毛首线虫分子鉴定及其ITS序列分析

为了解从滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)消化道检获的线虫种属关系,对虫体进行形态学鉴定、PCR扩增虫体ITS基因序列、测序分析,并利用MEGA 6.0软件构建遗传系统进化树。结果显示:检获虫体与毛首线虫(Trichuris sp.)相似度为99.05%,滇金丝猴所感染虫体为毛首线虫。进化树结果显示样品与人感染的毛首鞭形线虫(Trichuris trichura)亲缘关系较近,表明二者为近缘种,具有人兽共患风险,这可为灵长类动物毛首线虫的鉴别诊断、种群结构等更深入地研究提供理论依据。     

异形同刺线虫形态学鉴定及基于核糖体ITS序列分子进化分析研究

对采自黑龙江省某鹅场莱茵鹅盲肠内的线虫进行形态学鉴定,然后采取PCR方法扩增虫体核糖体ITS序列,进行序列分析并以ITS序列为标记基因构建系统发生树,分析该线虫与其他虫体的进化关系。结果表明,所分离的虫体为异形同刺线虫(Ganguleterakis dispar),该线虫ITS序列全长为957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分别为424 bp,157 bp和376 bp。应用BI,MP,NJ 3种方法构建系统发生树结果相同,在尖尾目线虫的分支中,本研究的5条异形同刺线虫聚集在一起,与同科的鸡异刺线虫亲缘关系较海绵异刺线虫和Heterakis dahomensis接近。该结果为禽类异形同刺线虫病的分子鉴别诊断方法提供了参考。     

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748~843 bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367~370 bp和228~320 bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153 bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%~48.5%)明显高于ITS2区(37.7%~40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%~3.5%和5.6%~31.8%;而种内差异性分别为0~0.5%和0~0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%~99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。     

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。     

本地毛形线虫HSP70基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的布氏旋毛虫HSP70基因序列设计了1对引物，用Trizol法从本地毛形线虫肌幼虫虫体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增了HSP70基因，将目的基因克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒用PCR、限制性内切酶BarnHⅠ和HindⅢ进行单、双酶切鉴定。测序结果表明，成功克隆了本地毛形线虫HSP70基因。序列分析表明，HSP70基因比较保守，不同物种之间氨基酸的同源性在40％～80％。与布氏旋毛虫HSP70序列相比，CDS区多出9个碱基，但核苷酸序列和氨基酸同源性分别为98%和94％，存在1个糖基化位点和1个潜在的信号肽位点。     

湖南省猬迭宫绦虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的ITS及5.8S rDNA序列总长存在一定差异,为1 369~1 393 bp,包含部分的18、28S及全部的ITS-1(662~687 bp)5、.8S(138 bp)及ITS-2(457~475 bp)序列。由于猬迭宫绦虫ITS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。     

猫锡兰钩虫rDNA ITS1的扩增及分子鉴定

为了对从猫粪便样品中分离的钩虫虫卵进行种类鉴定,本研究提取该虫卵基因组DNA,根据核糖体内转录间区1(ITS1)的保守序列设计钩虫属引物,通过PCR扩增、克隆、测序、相关软件分析,建立系统进化树,从分子水平对其进行种类鉴定.结果表明扩增出404 bp DNA片段,测序结果显示该片段包括309 bp ITS1和95 bp的5.8S rDNA,与NCBI中登录的序列进行比对以及采用Clustal X和MEGA5.1软件分析确定该钩虫为锡兰钩虫.这是我国首次建立钩虫的分子鉴定方法,也是40年来再次发现猫源锡兰钩虫,为锡兰钩虫分子生物学和分子流行病学研究奠定了基础.     

猬迭宫绦虫广东分离株线粒体pcoxl基因的克隆及序列分析

为阐明猬迭宫绦虫广东分离株的遗传变异情况,本研究利用PCR技术扩增了猬迭宫绦虫的部分细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(pcoxl)基因,经SSCP筛选出带型差异的代表样品进行测序,经系统发育树表明,广东分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝.同时研究表明猬迭宫绦虫pcoxl序列种内相对保守,又存在一定种间差异,可作为种间遗传变异研究的标记,研究结果为进一步研究猬迭宫绦虫的群体遗传结构奠定了基础.     

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000~2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基。其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点。除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E)。与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%~97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%~98.1%之间。     

猪圆环病毒2型分离毒株全基因组克隆与序列分析

猪圆环病毒(PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员,单股环状DNA病毒,为已知的最小动物病毒之一[1]。PCV存在两种血清型,即PCV1和PCV2,两者的细胞培养物均不产生细胞病变。PCV2首先由Allan等[2]从患断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中分离到,被证明为PMWS的重要病原     

禽呼肠孤病毒分离株δ3蛋白基因克隆及序列分析

本研究将禽呼肠孤病毒广西两分离株R1、R2和美国分离株Iso1 S1基因中编码σ3蛋白的基因片段进行克隆和鉴定.对克隆片段测序后与参考株S1133、1733、138、176毒株的S1基因相应序列进行比较分析.结果表明,广西分离株R1、R2与美国分离株Iso1以及S1133、1733、176毒株的核苷酸和推导氨基酸的同源性均在95%以上,上参考株138的同源性在81%～85%之间.由此可见,除了与138参考株外,广西分离株R1、R2和美国分离株Iso1与其他比较的毒株的S1基因上存在很大的相关性.     

一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析

应用猪繁殖障碍性病毒性疫病6重PCR检测方法对贵州省开阳县某规猪场送检的1头疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病死仔猪进行病原检测,确诊感染有猪圆环病毒2型(PCV2)后,对该病毒全基因组进行扩增,将其克隆到pMD19-T Simple载体上,筛选获得了重组质粒pMD19-T-PCV2,并对其进行序列测定和分析。结果表明:克隆得到的PCV2毒株的基因组全长为1 767 bp,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为94.1%⁹8.4%,根据欧盟猪圆环病毒疾病委员会规定的PCV2基因型划分标准,将PCV2 GZ-KY1毒株划分为PCV2b亚型。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

羊驼生长激素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和PCR技术克隆得到了羊驼生长激素(Growth hormone,GH)基因,包括完整的编码区812 bp 的cDNA序列和1 800 bp 的DNA序列.两者比对后证明羊驼GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽.序列比较结果表明,羊驼GH基因序列与骆驼、猪、马、犬和猫等哺乳动物类似,但羊驼GH基因的启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而同骆驼一样为CATA盒.在DNA和cDNA水平以及推导的氨基酸水平,均与骆驼的同源性最高.通过GH氨基酸的功能位点分析推测,羊驼生长激素与人、猪等大多数动物的生长激素无明显功能上的差异.     

饲用木聚糖酶基因的克隆及序列分析

以实验室自行分离筛选出的产木聚糖酶短小芽孢杆菌HZ-01的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到一条含有木聚糖酶基因的DNA片段,对其进行序列比对及生物信息学分析,结果表明,该基因全长为687 bp,编码228个氨基酸,理论分子质量约为25 kDa,存在4个潜在的N-糖基化位点,密码子使用存在偏爱性.