马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白（p15)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达，所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化，在间接ELISA和免疫印迹试验中，重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应，这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体人免疫应答的研究中。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株跨膜蛋白主要免疫决定区基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码跨膜蛋白主要免疫决定区(TMIR)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的融合蛋白有一部分是可溶的，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中，重组的TMIR蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制、接种马体内免疫应答及马传贫诊断的研究。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定

本项研究以马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒感染细胞总ＤＮＡ和驴强毒感染驴外周血病毒ＲＮＡ为起始材料,应用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ的方法,分段扩增出马传贫弱毒疫苗毒前病毒和驴强毒各基因,并将各基因克隆后进行测序。根据与国外发表的马传贫病毒核苷酸序列比较,推导出马传贫疫苗毒和马传贫驴强毒全基因组核苷酸序列。     

EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒基因核苷酸序列测定

本项研究马传贫驴白细胞弱毒疫苗病毒感染后总ＤＮＡ和驴强毒感染驴中血病毒ＲＮＡ为起始材料,应用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ的方法,分段扩增马传贫弱毒疫苗病毒和驴毒各基因,并将各基因克隆后进行测序列,根据与国外马传贫病毒核苷酸序列比较,推导出马传贫疫苗毒和马传贫驴强毒全基因组核苷酸序列。     

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马病专家赵立平

赵立平(1955-)，哈尔滨人，大专，实验师。70年代参加了马传染性贫血病的研究工作，80年代以后，主要进行马传染性贫血病驴胎皮肤细胞弱毒疫苗和马传染性贫血病琼扩抗原的研究。1995年、1999年先后两次赴古巴进行国际合作进行马传贫驴白细胞弱毒疫苗的生产，打开了该疫苗在欧美的国际市场。     

马传染性贫血病驴白细胞弱毒株的致弱及免疫机理的研究

马传染性贫血病 (EIA)是由反转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒 (EIAV)引起的一种马属动物传染病。在慢病毒属中 ,EIAV与人免疫缺陷病毒 (HIV)在传播形式 ,单核细胞为病毒贮存库 ,病毒形态结构 ,病毒持续感染 ,病毒抗原漂移 ,EIAV的 P2 6与 HIV的 P2 4之间抗原交叉反应等都更为相似。至今 ,我国马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗 (DL V)是目前世界上唯一成功应用的慢病毒疫苗 ,是慢病毒免疫预防很有希望的研究模型。因此 ,揭开 DL V的致弱及免疫机制 ,这使 EIAV有可能作为研究 HIV等慢病毒的致病机理及免疫机制的模型。EI…     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒疫苗株S基因的克隆及其与流行株的比对分析

[目的] 分析猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）疫苗株和流行株S基因的遗传变异特征。[方法] 利用RT-PCR方法对国内目前广泛使用的TGEV疫苗株A、B、C的S基因进行克隆并测序,将获得的序列与近年来公开发表的分离自不同地区的TGEV 毒株S基因序列进行比对分析;选取NCBI中登录号为AF104420.1-Britain、AY587882.1-Nanjing、DQ811786.2-America、EU074218.2-Harbin、FJ755618.2-Harbin、JQ700304-fuzhou、KC609371.1-Shanghai、KX900411.1-United States、M94099.1-Spain和MK272773.1-Fushun 的TGEV 流行株S基因序列,与疫苗株A、B、C的S基因序列一起,利用MegAlign软件进行比对分析。[结果] 疫苗株A、B、C的S基因序列两两间的同源性均在96.7%以上;疫苗株A、B、C的S基因序列与NCBI中流行株S基因序列的同源性分别在94.43%~99.82%、95.30%~99.64%、93.48%~98.38%;由遗传进化树可知,疫苗株A、C与国外流行株M94099.1-Spain在同一分支上,疫苗株B与国内流行株JQ700304-fuzhou在另一分支上。[结论] TGEV疫苗株的S基因与流行株同源性较高,变异性不大。     

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达

根据美国马传染性贫血病病毒（EIAV）Wyoming株基因序列,设计扩增EIAVgag和p26基因的引物,用PCR法能忠实的分别扩增出全长gag和p26基因。经用杆状病毒表达系统对所获gag和p26基因进行克隆和重组,获得了高效稳定表达Gag和p26蛋白的重组杆状病毒（rBVs）。含有gag和p26基因的重组杆状病毒感染昆虫Sf21细胞,经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化,每升培养物能获得2mgCag或12mgp26蛋白。     

传染性支气管炎病毒疫苗株H52的全基因组克隆与分析

采用RT-PCR方法克隆测定传染性支气管炎病毒（Infections Bronchitis Virus,IBV）疫苗株H52全基因组序列,并与其它已知全基因组序列的我国分离株进行比较分析,以分析我国IBV地方分离株与疫苗株的分子遗传关系。结果表明,H52基因组全长为27630bp（不包括polyA）,A＋T含量为61．8％,它与我国IBV分离株全基因组同源性在83．9％～95．2％之间,其中与KQ6的同源性最高（95．2％）,与其余株均在88％以下。在基因组内基因的同源性中,以S1、S2与E变异最大,除KQ6外,其余各株（含台湾株）与H52在S1蛋白上的同源性只有72．4％～80．7％,在S2蛋白上的同源性为85．5％～88．1％,E蛋白为82．9％～93．3％。系统进化分析表明,国内分离株,除KQ6外,在进化分支中已独立于H52和其它Massachusetts型衍生毒株。H52与我国地方分离株存在较大的分子遗传差异,这些差异可能导致单纯Massachusetts型疫苗（如H120,H52）不能有效地免疫保护我国的鸡群。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。     

马传贫弱毒疫苗免疫机理的研究：—马传贫弱毒接种马、驴体内病毒抗原跟踪观

用免疫荧光技术对接种马传贫弱毒的14匹马和20头驴体内病毒抗原进行了8－9个月的连续跟踪观察，结果表明，病毒抗原主要出现在肝淋、脾淋、脾淋、蛋白髓等免疫器官，其形态主要有三大类，第一类存在于巨噬细胞胞浆内；第二类是以免疫复合物形式附贴在增生的嗜酸性粒细胞及其崩解的颗粒上，第三类的为泡沫样无定型荧光，主要存在于肾细胞管管腔中，本文就弱毒抗原在体内持续存在的机理，弱毒抗原与免疫形态学及机体免疫状态关系，神经内分泌调节在免疫发生中的作用以及马与驴免疫形态差异产生的原因等进行了讨论。     

国产IBV疫苗株膜蛋白基因的亲缘关系研究

利用自行设计的引物Wx和Ws，通过RT－PCR方法分别扩增出IBVD41株、H120GD株、H120SH株、H520GD株4个国产疫苗株和标准强素M41－E4株完整的M基因cDNA，然后将其分别克隆到pGMET－Easy或pMD18－T载体中。测序结果发现：这5个IBV毒株的M基因均为678bp，分别编码由225个氨基酸残基组成的多肽。序列分析表明：D41株、H120GD株和H120SH株M基因之间的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性均为100％，它们在系统发生进化树中处同一分支；而H52GD株和国内的M41－E4株和国外的M41株M基因之间的核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为99．9％和99．6％，它们之间的亲缘关系最近，在系统发生进化树上处另一个分支。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

马传染性贫血病的诊断与防治

简称马传贫（EIA）,由反录病毒科（Retroviri—dae）慢病毒亚科（Lentivirinae）中的马传染性贫血病病毒引起,马、骡、驴常染有此类传染病。其特征主要为间歇性发烧、消瘦、进行性衰弱、贫血、出血和浮肿,在无烧期间则症状逐渐减轻或暂时消失。本病仅能感染马属动物（马、骡、驴）。在自然条件下,以马的易感性最高,骡、驴次之。