甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

水稻MAPK基因OsMPK4的克隆鉴定、蛋白表达和转基因载体构建

克隆鉴定了一个水稻促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)基因OsMPK4.OsMPK4基因cDNA全长1483 bp,包含一个1131 bp的开放阅读框,编码一个由376个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为42.8 kD.OsMPK4基因位于水稻第10号染色体上,由6个外显子和5个内含子组成.OsMPK4蛋白具有MAPK的11个保守结构域及磷酸化位点TEY模体.系统进化树分析表明,OsMPK4属于B组MAPK成员,与已知水稻MAPK蛋白有56%～74%的一致性.原核表达了OsMPK4基因,纯化获得重组OsMPK4融合蛋白,并构建OsMPK4的转基因双元载体,用于OsMPK4的生化功能及其生物学功能研究.     

水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

根据水稻干尖线虫转录组测序结果,采用c DNA末端快速扩增技术(RACE法)从水稻干尖线虫中克隆到效应因子SPRY同源基因,并将其命名为Ab–SPRYSEC(NCBI登录号为KT188820)。该基因全长为2 089 bp,包含1个1 962 bp的开放阅读框(ORF)。预测蛋白编码653个氨基酸,相对分子质量为72 009,理论等电点为4.82,不稳定指数为41.5,属于不稳定性蛋白。保守区预测分析结果表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH 2个保守结构域,属于SPRY超家族。多序列比对分析结果表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白的相似度为43%。蛋白结构分析结果表明,β–折叠与无规则卷曲是Ab–SPRYSEC蛋白的主要结构元件。表达定位分析结果表明,Ab–SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab–SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫效应因子,在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

水稻dirigent基因家族生物信息学分析

摘　要：利用现有的水稻生物信息资源,共鉴定出了53个水稻dirigent (OsDIR)基因,它们分布在8条水稻染色体上;基因结构分析显示,有32个OsDIR基因不含内含子,占总数的60.4%;保守功能区域预测表明,OsDIR基因至少含有1个保守的DIR功能域;模块预测显示,水稻DIR蛋白拥有至少10个大小不同的保守模块,且不同模块在基因家族成员中出现的频率有较大的差异;蛋白序列比对表明,该基因家族蛋白保守序列均位于DIR功能域内;蛋白功能预测表明,大多数OsDIR蛋白为稳定的疏水性蛋白,表达于大多数细胞器中,且在细胞壁中表达最为丰富;同源基因分子遗传进化分析表明,OsDIR基因可分为5个亚类,功能域片段与基因的复制特征表明,OsDIR基因可能起源于共同的祖先(基因)。     

苦荞粒重基因FtGW8的生物信息学分析

种子大小和重量是荞麦产量构成的关键因素.该研究基于水稻粒重基因GW8,对苦荞粒重基因进行了生物信息学分析,结果表明,苦荞粒重FtGW8基因CDS序列长768bp,编码的蛋白质包含255个氨基酸,分子量为27.97kD,等电点为9.5,属于亲水性蛋白,具有跨膜结构,与水稻GW8蛋白相似.预测FtGW8蛋白定位于细胞核内,其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,预测的三级结构与二级结构基本一致.蛋白功能分析发现,FtGW8和水稻GW8蛋白均具有SBP功能域,表明其可能具有控制粒重的功能.该研究为苦荞粒重基因的克隆奠定了基础.     

陆稻过氧化氢酶基因（OsCATB-lh） 的克隆及生物信息学分析

为深入了解陆稻过氧化氢酶(CAT)基因的序列特点和生物信息学信息,以粳型陆稻品种泸旱3号为材料,利用同源克隆技术成功获得1条陆稻CAT基因序列(Gen Bank登录号:KR133179)。该序列全长1 739 bp,其中编码区ORF全长1 479 bp,编码492个氨基酸。生物信息学分析发现,此基因是位于水稻基因组第6号染色体的单拷贝基因。对其编码蛋白分析表明,其具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。与水稻CAT基因序列(Os CATB)进行比较发现,Os CATB-lh与水稻Os CATB基因核苷酸序列一致性达到99%,存在6个核苷酸差异位点;与水稻Os CATB蛋白序列一致性为99%,有3个氨基酸变异位点。     

黄瓜RNA解旋酶基因家族的生物信息学鉴定和表达分析

利用生物信息学方法对黄瓜RNA解旋酶基因家族成员、基因分类、染色体定位和系统进化关系进行了分析预测,并利用实时荧光定量PCR技术检测了11个黄瓜DEAD-box RNA解旋酶基因的组织表达模式和NaCl、低温4℃、脱落酸(ABA)以及高温39℃胁迫条件下的表达变化。结果表明,黄瓜RNA解旋酶家族包含101个基因,DEAD-box、DEAH-box和DExD/H-box 3个亚家族分别包含32、27和42个基因成员;黄瓜的7条染色体均有RNA解旋酶基因分布,其中第3条染色体最多,有30个RNA解旋酶基因,仅有8个基因分布在第4条染色体上;黄瓜RNA解旋酶基因编码的蛋白包含376~2 330个氨基酸,等电点在5.13~10.00;qRT-PCR分析发现,除CsDEAD16和CsDEAD25外,其他基因在花中表达量均最高,在黄瓜根中仅检测到CsDEAD17、CsDEAD21、CsDEAD22和CsDEAD24的表达;黄瓜幼苗经上述胁迫处理后11个基因均有不同程度的表达量变化,其中CsDEAD16、CsDEAD21、CsDEAD22、CsDEAD24、CsDEAD25和CsDEAD27明显受ABA上调,而CsDEAD24的表达受高温诱导。本研究为进一步探索黄瓜RNA解旋酶基因在其生长发育中的作用和抗性作用机制,奠定了一定的理论基础。     

日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牛儿基牛儿基氢化酶(GGH)基因cDNA序列为信息探针,搜索GenBank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1 389 bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架(ORF),推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牛儿基牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91%、89%、84%、81%7、3%、74%。该基因与叶绿素等的生物合成有关。     

水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

效应蛋白是线虫食道腺分泌物的重要组分,广泛存在于植物寄生线虫中,在线虫整个生长发育及侵染寄生中起到重要作用。根据水稻干尖线虫转录组测序结果,并通过RACE法从水稻干尖线虫中克隆到一SPRY基因,命名为Ab-SPRYSEC。该序列全长为2089 bp,包含一个1962 bp的开放阅读框(ORF)。预测编码653个氨基酸,蛋白相对分子量为72.009 kDA,理论等电点为4.82,不稳定指数41.5,属于不稳定性蛋白;保守区预测分析表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH两个保守结构域,属于SPRY超家族;多序列比对分析表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白相似度最高为43 %;蛋白结构分析表明,β-折叠与无规则卷曲是Ab-SPRYSEC蛋白主要结构元件;表达定位分析显示,Ab-SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab-SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫一效应因子,可能在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

油桐ACPase基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆油桐酸性磷酸酶(ACPase)基因的全长序列,为进一步分析油桐ACPase的功能奠定基础。【方法】根据油桐转录组酸性磷酸酶蛋白全长序列设计引物,利用RT-PCR从油桐种子中克隆ACPase基因,对其cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、跨膜结构、二级结构及三级结构进行分析预测,同时进行多序列比对并构建系统树。【结果】克隆获得油桐ACPase基因,其开放阅读框为1152 bp,编码383个氨基酸残基,相对分子质量为40.94 kDa,理论pI为5.30,属可溶性不稳定蛋白。同源性和进化树的预测分析结果显示,油桐ACPase与毛果杨的ACPase蛋白同源性达84%。油桐ACPase存在磷酸酶基因家族的保守区域,ACPase编码蛋白的大部分氨基酸属于亲水性氨基酸。其蛋白二级结构主要由不规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构成。ACPase蛋白包含1个跨膜螺旋区域,其相应氨基酸位置在136~156;包含1个疑似跨膜域,其相应氨基酸位置在255~275;每个跨膜结构域为由20个氨基酸残基组成的螺旋,同时跨膜蛋白的N端和C端位于细胞膜胞质的一侧。【结论】油桐ACPase基因的表达可能与其体内磷营养的分解利用等过程有关。     

大豆解螺旋酶基因GH1的克隆与载体构建

非生物胁迫（高盐、低温、干旱）严重限制植物的生长与发育。研究表明,高等植物中的DEAD-box RNA解螺旋酶广泛参与植物非生物胁迫应答,过表达解螺旋酶基因可明显改良转基因植株的抗逆能力。目前,大豆的RNA解螺旋酶基因序列也已发现,但其具体功能还不明晰,有待进一步研究确定。本实验以大豆为实验材料,根据Genbank发表的RNA解螺旋酶基因GH1的序列设计引物,通过RT-PCR的方法将其体外扩增并构建相应的表达载体,为下一步的研究奠定基础。     

Identification of the DEAD-box RNA helicase family members in grapevine reveals that VviDEADRH25a confers tolerance to drought stress

Grapevine growing areas are increasingly affected by drought,which has greatly limited global wine production and quality.DEAD-box is one of the largest subfamilies of the RNA helicase family,and its members play key roles in the growth and development of plants and their stress responses.Previous studies have shown the potential of DEAD-box genes in the drought stress responses of Arabidopsis and tomato,rice,and other crop species.However,information about DEAD-box genes in grapevine remains li...     

The DEAD-box RNA helicase Dbp5 functions in translation termination

In eukaryotes, termination of messenger RNA (mRNA) translation is mediated by the release factors eRF1 and eRF3. Using Saccharomyces cerevisiae as a model organism, we have identified a member of the DEAD-box protein (DBP) family, the DEAD-box RNA helicase and mRNA export factor Dbp5, as a player in translation termination. Dbp5 interacts genetically with both release factors and the polyadenlyate-binding protein Pab1. A physical interaction was specifically detected with eRF1. Moreover, we show that the helicase activity of Dbp5 is required for efficient stop-codon recognition, and intact Dbp5 is essential for recruitment of eRF3 into termination complexes. Therefore, Dbp5 controls the eRF3-eRF1 interaction and thus eRF3-mediated downstream events.     

湖北白猪IGF-1基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-1）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-1基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-1基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子,539～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-1基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-1基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

湖北白猪IGF-I基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-I）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-I基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607 bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-I基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子5,39～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-I基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-I基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-I基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。     

水稻OsRop4基因的克隆及其植物过量表达载体的构建

根据NCBI中水稻OsRop4基因序列设计引物,通过RT-PCR获得了水稻的OsRop4基因的3个转录本,其中1个转录本序列与GenBank中该基因的序列相同,含1个648bp的开放阅读框,编码215个氨基酸,另外两个转录本分别在编码序列内部缺失了64bp和104bp的核苷酸序列.将这3种转录本分别与植物过量表达栽体PHB相连,对所获得的重组质粒进行双酶切.鉴定结果表明,植物过量表达载体PHB-OsRop4构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因的克隆、序列分析与原核表达

【目的】克隆乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1（melanocortin 1-receptor,MC1R）基因,并对其进行生物学分析和原核表达。【方法】采集乌骨鸡的肌肉组织,提取其总RNA,根据GenBank上公布的原鸡（Gallus gullus）MC1R基因序列设计引物,利用反转录RT-PCR克隆乌骨鸡MC1R基因,对其进行生物学分析,并构建原核表达载体pET32a-MC1R,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。【结果】乌骨鸡MC1R序列由945个碱基组成,编码314个氨基酸。成功构建了重组质粒pET32a-MC1R的原核表达系统,并且体外诱导获得了MC1R蛋白。【结论】成功克隆了乌骨鸡MC1R基因并分析了其与乌骨鸡乌色性状的关系,其与原鸡的亲缘关系最近,达99.4%,经原核表达获得了乌骨鸡MC1R蛋白。     

纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析

设计引物进行PCR反应,从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增和克隆纳豆激酶基因.序列分析表明,所克隆的纳豆激酶基因序列全长1 473 bp,其中阅读框架1 143 bp,阅读框架以GTG为起始密码子,编码包括信号肽、前导肽、成熟肽在内的381个氨基酸;表达产物为前纳豆激酶原,其中N端29个氨基酸组成信号肽,随后的77个氨基酸组成前导肽,最后的275个氨基酸组成成熟肽.