草酸青霉菌I1的cDNA文库构建及其溶磷相关基因的筛选

【目的】构建草酸青霉菌I1的cDNA文库,筛选溶磷相关基因。【方法】利用SMART技术构建草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,通过难溶磷培养基筛选具有溶磷能力的转化子,测序并进行生物信息学分析。在难溶磷液体培养基中,进行转化子对溶液pH值、可溶磷含量的影响和产有机酸试验。【结果】成功构建了草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,其库容量约为5.29×106 cfu•mL-1,重组率为99%;利用难溶磷固体培养基筛选,得到具有溶磷圈的转化子48个,其中转化子I-4的cDNA序列全长536 bp,为一个新的序列,基因编码氨基酸残基序列长129 n.t。转化子E. coli HST08 I-4在液体难溶磷培养基中培养,提高了有机酸的表达量,并增加了有机酸的种类,在培养12 h后,开始产生乙酸,24 h后,溶液中产生乳酸、苹果酸和α-酮戊二酸,培养36 h,溶液pH值由6.32降到3.69,可溶磷含量达到0.1076 mg•mL-1。【结论】从草酸青霉I1中筛选到一个溶磷相关基因pstI。     

鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。     

草酸青霉菌(P-o- 41)发酵液对小麦病害的诱导抗性作用

不同浓度的草酸青霉菌(P-o- 41)[1,2]发酵代谢物处理珊西烟的一张叶片,在另外的叶片上摩擦接种TMV,比较处理叶片与无菌蒸馏水对照叶片上的枯斑数.结果表明,稀释1 000倍的发酵代谢物处理及百万分之三十八的BTH处理与清水处理对照相比,枯斑抑制率(;)分别达到84.05;和79.96; ;对小麦白粉病的诱抗效果分别达到60.88; 和69.43; ;对小麦普通根腐病的抑制率在P0.01水平上达到显著差异,而平板圆盘测定结果表明,草酸青霉菌(P-o-41)发酵液对小麦根腐病菌无抑制作用.     

兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法（EDC），将MTR与牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HSA）和鸡卵清蛋白（OVA）共价偶联，分别合成免疫抗原MTP－BSA、MTP－HSA和包被抗原甲胺磷－鸡卵清蛋白（MTP－OVA），用合成的免疫抗原对新西兰大白兔进行免疫，制得抗血清经鉴定确证为兔抗MTP多克隆抗体（polyclonal antibody,PAB)，效价分别为1：15000和1：12000。     

7株青霉菌的分离与鉴定

在济南某场所进行空气采样,对其中含有的真菌进行分离、纯化及鉴定.共分离纯化出7株霉菌菌株,通过菌落形态特征、培养特性、DNA-ITS序列等鉴定手段,确认该7株菌株全部为青霉菌属.     

一株甲磺隆降解真菌(Penicillium sp.)的降解特性研究

Penicillium sp.的纯培养试验结果表明:Penicillium sp.的最适降解条件为甲磺隆浓度22.6mg/L,菌体浓度12.25 mg/L溶液,温度30°C,pH 7.0.在有机肥浸出液为共基质时,甲磺隆降解速率可以提高约15%,但葡萄糖影响不显著.当Penicillium sp.加入到华家池潮土中时,可明显促进土壤甲磺隆的降解,且有较好的持续性,从而使甲磺隆在土壤中的半衰期由对照的27.7 d缩短到16.5～18.8 d.     

土壤-作物系统中农药残留生物降解去除研究

采用水稻小区及大田试验方法，研究了将人工分离筛选培养的农药降解菌(DLL—1)应用于水稻作物的田间试验。试验结果表明，将降解菌喷施应用于土壤和作物系统，能加速和强化作物表面残留农药的降解作用，最终能减少土壤和农产品中农药残留量。     

两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究

从纤维素富集的环境中采集82个落叶层下面的土壤和腐朽的树木样品,经过初筛获得大约3500株纤维素降解真菌,二次筛选后得到16株纤维素酶活性较高的真菌.以Avicel为底物,测定16株纤维素降解真菌的粗酶活性,发现真菌菌株S10和X5对Avicel有明显的活性,分别为0.119IU/mL、0.025IU/mL.通过形态学观察和rDNA的ITS(内转录间隔区)序列分析,菌株S10被鉴定为针尾曲霉(Aspergillus aculeatus),菌株X5为草酸青霉(Penicillium oxalicum).对针尾曲霉S10和草酸青霉X5的粗纤维素酶的酶学性质进行初步研究,发现粗酶活性最高的最适pH值分别为5.0、6.0,最适反应温度分别为50～60℃、45～50℃.     

微生物修复剂S35对氯氰菊酯污染棚室土壤修复研究

对复合微生物菌剂S35在土壤中对氯氰菊酯的降解效果及其生态安全性进行了监测研究。通过在棚室土壤中添加氯氰菊酯并施用菌剂,定期监测土壤中残留氯氰菊酯、菌剂S35微生物定殖水平,土壤真菌微生物多样性变化,土壤理化指标,种植作物生长指标从而评估菌剂施用效果及其安全性。结果表明初始土壤中氯氰菊酯含量约85 mg/kg,使用0.1%菌剂,经过40 d修复期后,修复土壤中残留的氯氰菊酯浓度降至9.25 mg/kg,下降了约89%,对照组残留量为48.34 mg/kg,下降了约47%,与对照相比具有显著差异(T-test p=0.04)。复合菌剂S35中的效能微生物SSCL-3,SSCL-5可在土壤中稳定的定殖并发挥降解氯氰菊酯的作用。S35菌剂可逐步改善了污染土壤的真菌微生物多样性,土壤理化指标及观测作物番茄生长未受到菌剂负面影响。可以初步认为S35是有效并且安全的氯氰菊酯污染土壤修复剂。     

四川不同环境茶园中铅与甲胺磷含量的分析评价

试验对四川省不同环境茶园中茶叶的铅与甲胺磷含量进行了检测分析,14份茶样中的铅含量为0.11~4.79 mg/kg,平均值为1.76±1.26 mg/kg,均没有超过国家最大限量标准5 mg/kg,28.6%茶样超过国家绿色食品标准中的铅限量值2 mg/kg,其中靠近公路的茶样中铅含量明显高于远离公路的茶样;3份茶样检出有甲胺磷残留,浓度在0.03~0.06 mg/kg.结果表明,四川省茶园的环境卫生状况比较好.     

溶磷草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究

 采集石灰性土壤样品进行了溶磷微生物的筛选 ,获得了具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1。不同培养条件下测定了它们的溶磷能力 ,并与拜莱青霉菌ATCC2 0 85 1和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14 5 81进行了比较。在固体培养基上草酸青霉菌P8、Pn1表现较强的溶解Ca3 (PO4) 2 、Ca8H2 (PO4) 65H2 O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力 ;在液体培养条件下 ,能有效的溶解摩洛哥磷矿粉 ,氮源对其溶磷效果有显著影响 ,硝态氮高于铵态氮 ;接种P8能够显著增加灭菌和不灭菌土壤的有效磷含量 ,灭菌土壤增加的有效磷略高于不灭菌土壤。氮源影响草酸青霉菌产生有机酸的种类 ,使用铵态氮时主要分泌苹果酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸 ,而硝态氮条件下几乎不再产生这些有机酸。这表明 ,氮源形态影响了它的代谢方向 ,而且它的溶磷机理不只一种 ,其机理尚不清楚 ,有待研究     

500g/L抑霉唑乳油对柑橘青霉和绿霉病菌的抑制作用与防治效果

试验结果表明,5 0 0 g/L抑霉唑乳油对柑橘青霉病菌和绿霉病菌的抑制中浓度(EC50)分别为0.0136mg/kg和0.0129mg/kg。用400~800mg/kg的抑霉唑药液浸果1m in,捞起晾干,装箱入库常温贮藏,药后60d,对柑橘青霉、绿霉病的防效达93.11%~96.48%,极显著高于70%甲基硫菌灵用600mg/kg处理的防效(84.30%),且对贮藏期的柑橘没有药害,对果实的色泽和口味没有明显的影响。     

甲胺磷和三唑磷在稻田中的降解迁移及吸附研究

采用田间小区试验及室内模拟试验方法,研究了甲胺磷和三唑磷在稻田中的降解迁移和吸附情况。结果表明,稻田喷施甲胺磷和三唑磷农药,其残留分布状况为:植株(90%以上)>土壤>田水。甲胺磷在植株、田水和土壤中的残留降解半衰期分别为3.2～3.7、2.5～3.0、6.0～10.3d;三唑磷在植株和土壤中的残留降解半衰期分别为4.1～4.2、6.1～9.1d,在田水中施药后7d已检不出残留。甲胺磷在0～70cm土层中施药后60d内均有残留检出,三唑磷在0～10cm土层中药后15d已检不出残留。在湿润土壤中,甲胺磷的残留降解半衰期为1.7～5.9d,三唑磷为5.～35.6d;在淹水土壤中,甲胺磷和三唑磷则分别为2.5～10.7和9.9～34.7d。在同一种土壤中,三唑磷的吸附率和吸附常数(K)均大于甲胺磷;在不同土壤中的吸附随有机质含量和K值的增大而增加,甲胺磷的吸附为粘壤土>沙壤土>壤粘土;三唑磷为沙壤土>壤粘土>粘壤土。     

来源于青霉Penicillium sp. C6的β-1,3(4)-葡聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析

从青霉Penicillium sp. C6菌株基因组DNA中克隆到一个新的16家族的葡聚糖酶基因,命名为bglc6(GenBank登录号:JX854434)。其cDNA全长为1 044 bp,包含N端前20个氨基酸的信号肽序列和一个16家族的结构催化域。bglc6编码的氨基酸序列与Grosmannia clavigera kw1407的假设葡聚糖酶蛋白序列最高一致性为64%。成熟蛋白BglC6在毕赤酵母中已成功表达,酶学性质分析表明,BglC6最适pH为4.5,最适温度为50℃,在酸性范围内具有良好的稳定性。以大麦葡聚糖酶为底物时,BglC6的比活、Km及Vmax值分别为253.8 U/mg,8.42 mg/mL,478.4 μmol/min·mg。蛋白BglC6对大多数金属离子有较好的抵抗能力。因此,该葡聚糖酶在动物饲料行业领域中具有潜在的应用前景。     

联苯菊酯降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

联苯菊酯是一种广谱高效杀虫剂,大规模的应用使其广泛残留在环境中,因此筛选联苯菊酯的高效降解菌具有重要意义。从扬州农药厂附近的地表土壤取样,利用富集驯化培养分离得到一株编号为S8的降解细菌,经表形特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析其为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),该菌株在pH7.0和30℃的条件下,对100mg·L-1联苯菊酯的3d降解率达56.4%,半衰期为60.7h。其最适生长条件为:pH6.0～8.0,温度30～35℃,接种量5%。研究结果可为今后治理联苯菊酯残留污染提供理论参考。     

甲胺磷生物降解机理及其降解酶的生物合成技术

分析研究了甲胺磷生物降解的类型和机理,探讨了基因工程技术在甲胺磷生物降解过程中的应用。     

一株产植酸酶青霉的分类鉴定及其植酸酶基因克隆 和在毕赤酵母中的表达

植酸酶是催化植酸盐水解成磷酸盐的一类酶的总称,添加到猪和家禽动物的饲料中可以提高植酸磷的利用率和促进对矿质元素的吸收利用。根据形态特征和ITS分子序列,作者对该实验室筛选得到的高产植酸酶菌株青霉RCEF4908进行了鉴定,确定该菌株在系统分类上属于草酸青霉Penicillium oxalicum Currie&Thom。利用特异性引物扩增出植酸酶成熟肽基因片段,蛋白质序列含有保守区域RHGXRXP和HD,属于组氨酸酸性磷酸酶家族。通过基因操作成功实现了植酸酶在Pichia pastoris GS115的表达。转化子P49在诱导培养144 h后酶活性可以达到约8 000U·mL-1。重组植酸酶在pH 2.5～7.0之间都有活性,在pH 5.5时酶活性最高;在90℃水浴处理10、20和30 min后酶活性仍分别保留53.8%、52.5%和45.2%,具有较高的耐热性,适宜于作为饲料添加剂,有进一步开发的价值。     

甲胺磷降解细菌的筛选与降解特性研究

利用甲胺磷作为唯一碳源和氮源的培养方法,从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株降解菌MAP-3,初步确定MAP-3为假单孢菌属菌(Pseudomonas)。研究了该菌株降解甲胺磷的降解特性,该菌降解甲胺磷的最适温度为30℃,最适pH值为7.0,降解率达89%。MAP-3除了能降解甲胺磷外,还能降解敌敌畏、氧化乐果等有机磷农药。     

水体中硝基苯厌氧降解微生物的筛选及其降解特性研究

以硝基苯为碳源,采用间歇式曝气方式,经90d驯化培养,从处理硝基苯废水的生物活性污泥中分离得到13株高效降解菌,在厌氧环境条件分离纯化,筛选得到降解能力最强的MY4菌,并研究了其对不同浓度硝基苯的降解特性。结果表明,经16SrRNA鉴定,MY4菌属于兼性葡萄球菌属(Staphylococcus sp),其在104～107CFU·mL-1范围内对硝基苯的去除率没有显著差异,降解率均为65%,硝基苯的降解速率在3～5d期间达到最大。高浓度的硝基苯对微生物的降解过程存在抑制作用,随着浓度的增高,其降解半衰期明显延长。GC-MS分析表明,硝基苯经MY4菌株降解后的主要产物为苯胺。     

联苯菊酯降解微生物生长环境的优化作用研究

通过富集驯化培养,获得了降解联苯菊酯的混合微生物,研究表明：该混合微生物发挥最优降解力的温度是34℃,pH为7.1,培养时间为80h。采用联苯菊酯作为培养菌生长的唯一碳源、氮源和能源时,80h联苯菊酯去除率为63%。