环境激素２，４－二氯苯酚对家蚕生殖发育的影响

为了探讨环境激素对鳞翅目昆虫的影响,用添加2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)的人工饲料饲养家蚕,调查2,4-DCP对家蚕生殖发育的影响.结果显示,1.60mmol·kg~(-1)以下浓度的2,4-DCP,对幼虫和蛹的卵巢生长有促进作用(P<0.05);1.60mmol·kg~(-1)的2.4-DCP对5龄后期快速生长阶段的卵巢表现出抑制作用,但在蛹期卵巢的生长获得补偿.高浓度的2,4-DCP对幼虫期、蛹期卵细胞的生长和发育有一定的促进作用(P〈0.01).2,4-DCP对家蚕雄性生殖腺的生长、特别是5龄后期精巢的快速生长期表现出一定的抑制作用,在蛹期抑制作用表现十分强烈,1.60mmol·kg~(-1)的2,4-DCP使雄蛾蚕的精巢几乎完全退化.2,4-DCP使5龄幼虫的精细胞数量微弱减少,至蛹期精细胞和蛾期精子的数量则显著少于对照(P<0.01).1.60 mmol·kg~(-1)的2,4-DCP使雌蛾的产卵数下降到对照的20%,但造卵数比对照高1.3倍,0.80 mmol·kg~(-1)以上浓度的2,4-DCP使不受精卵率显著增高(P<0.05).2,4-DCP主要通过强烈抑制家蚕雄性生殖腺和生殖细胞的发育以表现出很强的雌激素效应.     

骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾离体细胞系和幼虫血细胞的毒性作用

【目的】研究骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾幼虫的杀虫作用机理,为此类生物碱作为新型植物杀虫剂的开发应用提供理论依据。【方法】从骆驼蓬成熟种子中提取骆驼蓬总碱,采用MTT法测定0,1,5,10和20μg/mL骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系(Sf9)的毒性;测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理10,30,50,70和90min时对Sf9细胞Na~+和K~+吸收的影响,并测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理1,2,3,4,5d后对葡萄糖吸收的影响;最后采用叶碟法(叶碟在20μg/mL骆驼蓬总碱中浸3s)和注射法(2μg/头)分别测定处理1,8,16,24和48h时骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量的影响。【结果】10和20μg/mL骆驼蓬总碱处理草地贪夜蛾Sf9细胞24h后,对细胞的抑制率分别为62.04%和83.25%;骆驼蓬总碱处理后8,16,24和48h,其对草地贪夜蛾Sf9细胞的LC50分别为35.32,23.21,14.87和8.98μg/mL,骆驼蓬总碱对Sf9细胞的毒性有时间滞后效应。5μg/mL骆驼蓬总碱处理Sf9细胞后10min,Sf9细胞对Na~+、K~+的吸收速率明显增加,处理后30min Sf9细胞对Na~+、K~+的吸收逐渐减弱;处理后3dSf9细胞对葡萄糖的吸收迅速增加,处理后4dSf9细胞对葡萄糖的吸收趋于停止。以叶碟法和注射法处理草地贪夜蛾4龄幼虫,8h后幼虫血细胞数量显著降低,但随时间延长幼虫血细胞数量又逐渐增加。【结论】骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf9有明显的毒杀活性,且对Sf9细胞中Na~+、K~+和葡萄糖的吸收具有抑制作用;对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量也有明显的抑制作用。     

甲基叔丁基醚对斑马鱼及中国仓鼠卵巢细胞的毒性效应

[目的]研究甲基叔丁基醚(MTBE)对斑马鱼和中国仓鼠卵巢细胞的毒性作用及氧化应激效应,为其科学、合理应用提供依据。[方法]应用半静态试验法研究不同浓度MTBE对斑马鱼的急性毒性效应,以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为模型,分析不同浓度MTBE对CHO细胞增殖水平和氧化应激相关酶活力水平的影响。[结果]MTBE对斑马鱼的48 h LC50值为71.5 mg/L;在细胞试验中,当MTBE暴露浓度高于5.0 mmol/L时,CHO细胞增殖水平受到明显抑制(P0.05);当MTBE暴露浓度达到50.0 mmol/L时,SOD活力明显上升(P0.05)。当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时,CAT活力达到最大值且与对照组差异显著(P0.05);当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时,CHO处理组GSH-Px活力明显上升(P0.05)。[结论]MTBE暴露可以诱导斑马鱼和CHO细胞的毒性作用,而氧化应激酶活力水平的改变可能是MTBE毒性作用之一。     

斑蝥素对昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9的作用效果

以昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9为试材研究斑蝥素对昆虫的杀虫机理。采用MTT法,结果表明,斑蝥素对这两种细胞凋亡的增殖有剂量和时间依赖性抑制作用,且对Sf9作用更为敏感:处理2,3,4 d后,斑蝥素对Spex-Ⅶ细胞的抑制中浓度(IC50)分别为17.623 8,13.225 1,10.707 8μg/mL;对Sf9细胞的IC50为5.433 8,1.228 9,1.222 6μg/mL;采用瑞氏-吉姆萨细胞染色和Hoechst33258荧光细胞染色法,结果表明12.5μg/mL斑蝥素处理Sf9细胞,25μg/mL和50μg/mL斑蝥素处理Spex-Ⅶ细胞,2 d后,斑蝥素对两种细胞有诱导凋亡的作用。可以观察到凋亡形态特征:胞膜完整,染色质固缩,核碎裂,凋亡小体形成。     

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15～1.50 μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35～3.50 μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24～48 h,喜树碱0.35～3.50 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1～10.0 μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)以0.048～4.800 μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.     

Sf9细胞存在Dm0-like核纤层蛋白的证据

为了确定Sf9细胞是否存在核纤层(lamina)及其性状,该文首先用已知的昆虫的核纤层蛋白(Lamin)的基因序列在Spodobase数据库搜索Sf9细胞的同源序列,并将推导的氨基酸序列与其他物种的同源蛋白进行比对。再利用抗果蝇Lamin Dm0抗体ADL67通过免疫印迹法(Western blotting)对Sf9细胞的蛋白裂解物进行检测,并通过免疫荧光技术(immunofluore-scence)对Sf9细胞进行染色。在Spodobase数据库搜索到1条Sf9细胞的Dm0-like lamin EST序列,同源比对显示它与其他物种的Lamin存在一定的同源性,尤其与家蚕、果蝇的同源性相对较高。免疫印迹结果表明Sf9细胞裂解物中存在大小约为70ku的蛋白,免疫荧光检测表明Sf9细胞核周呈现阳性反应,这些特征与已知的其他物种的核纤层的性状相似。结果表明,Sf9细胞可能存在Dm0-like核纤层蛋白,可作为探讨杆状病毒核衣壳穿过核纤层的机制之依据.     

siRNA-CyclinE对家蚕细胞增殖的影响

【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;流式细胞仪检测结果显示,2个转染组G0/G1期细胞比例显著增大,S期和G2/M期细胞比例显著减小。【结论】在家蚕BmN细胞中导入针对CyclinE的siRNA,可有效抑制CyclinE基因的表达,使细胞周期阻滞于G1期,进而抑制细胞增殖。     

2，4-二氯苯酚在太湖沉积物中的吸附/解吸行为研究

采用吸附、解吸动力学实验方法,研究了太湖沉积物对2,4-二氯苯酚(2,4-Dieldorophenol)的吸附、解吸规律,同时探讨了环境因子如温度、pH值以及离子强度等对其吸附行为的影响.结果表明,2,4-DCP在太湖沉积物中的吸附/解吸在4 h内快速达到平衡;线性等温式和Freundlich等温式都可以较好地描述太湖沉积物对2,4-DCP的吸附行为,即存在分配作用和表面吸附作用两种吸附机制;温度和离子强度的增加有利于沉积物对2,4-DCP的吸附,pH值对2,4-DCP吸附等温线的影响则不明显;2,4-DCP在贡湖沉积物中的吸附/解吸存在着明显的不可逆吸附,即吸附/解吸迟滞行为.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ)基因组DNA同源重复区hr1大小为1 746 bp,含有6个64 bp不完全回文序列、4个正向重复序列以及7个与病毒基因组DNA复制相关的基序。瞬时表达分析结果表明,SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)和苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的BmN和Sf21细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能,增强效率分别为30、350倍;实时荧光定量PCR结果显示,hr1在BmN和Sf21细胞中具有基因组DNA复制起始原点的功能,拷贝数分别为(8.46×10~4±6.13×10~3)、(5.92×10~6±2.95×10~5)copies/μg DNA。研究证明,SpltNPVⅡhr1在异源细胞BmN和Sf21中具有复制起始原点和增强子的双功能作用。     

利用淘汰奶牛卵巢生产体外受精胚胎

以淘汰奶牛卵巢为材料,研究了卵巢采集方法、卵丘细胞和颗粒细胞对卵母细胞体外受精后发育的影响。结果表明奶牛屠宰后取其卵巢,用剖解法(平均9.1枚/卵巢),可比抽吸法(平均6.5枚/卵巢)得到更多的可用卵母细胞(p<0.01)。周围无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞经成熟培养和体外受精后,卵裂率为41.8%,但仅27.5%停留在8～16-细胞期,最高发育阶段为16-细胞期;有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-OocyteComplex,COC)经成熟培养和体外受精后,卵裂率(64.5%VS54.7%,p<0.01)和囊胚发育率(34.0%VS18.2%,p<0.01)显著高于卵丘细胞包被不全的卵母细胞。在培养液中添加颗粒细胞虽然没有促进牛受精卵的卵裂率,但提高了囊胚率及其细胞数(p<0.01).     

纳米Fe3O4协同微生物对除草剂2,4-D的降解

 【目的】采用纳米Fe3O4协同微生物降解水溶液中2,4-D,提高2,4-D的降解效率,为有机氯农药污染环境的生物修复提供理论基础。【方法】利用纳米Fe3O4的还原作用脱去2,4-D环上的氯原子,使其毒性降低或消除;再利用微生物的共代谢作用,引入降解菌,协同降解2,4-D。通过分析纳米Fe3O4与微生物之间的相互关系,揭示纳米Fe3O4与微生物降解的协同作用机理。【结果】纳米Fe3O4对2,4-D有还原降解作用,投加纳米Fe3O4体系中2,4-D浓度降低、氯离子浓度升高,纳米Fe3O4对2,4-D的降解是一个还原脱氯过程;微生物能以2,4-D为C源,投加降解菌体系中2,4-D浓度降低、微生物生长的OD600值增大,2,4-D为微生物生长提供营养;纳米Fe3O4/微生物联合体系能明显加快2,4-D的降解,7 d时2,4-D的残留率降至35.7%,远低于纳米Fe3O4或微生物单独降解体系中2,4-D的残留率。采用微生物对中间产物2,4-DCP进行降解,反应5 d时,2,4-DCP 的残留率为50.1%,相应地,降解菌生长的OD600值为3.29。【结论】纳米Fe3O4/微生物联合体系对2,4-D的降解效率显著高于单一纳米Fe3O4或微生物体系;纳米Fe3O4能够刺激微生物的生长,2,4-D还原降解的中间产物2,4-DCP比2,4-D更易于被微生物降解。     

家蚕miR-14的上调表达与靶基因的预测分析

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列（pri-mir-14）并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和negative control mimcs转染至家蚕BmN细胞,观察EGFP及FAM在细胞中的荧光情况,以检测其转染效率,qRT-PCR方法检测bmo-miR-14在细胞中的水平。分别采用RNAhybrid和miRanda预测bmo-miR-14的靶基因。【结果】重组表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14与miRNA模拟物bmo-miR-14 mimics都能上调BmN细胞中的miR-14水平,与对照相比分别提高了2.1、984倍。利用生物信息学方法预测bmo-miR-14靶基因,RNAhybrid和miRanda分别预测得到153和171个潜在bmo-miR-14靶基因,其中两者共同预测的靶基因有49个。GO分析结果显示,预测的49个靶基因的分子功能集中于结合和催化;而生物学过程集中于细胞过程和代谢过程。【结论】通过转染重组质粒及化学合成miRNA mimics,使细胞中相应的miRNA上调,可用于bmo-miR-14后续的功能研究。     

RNA干涉家蚕细胞Ago蛋白家族基因的表达研究

分别构建RNAi(RNA interference,RNAi)载体干扰家蚕细胞BmN中Argonaute1(Ago1)和Argonaute2(Ago2)基因的表达。首先利用PFBDM和pBac[A3-EGFPafm]载体构建Ago1和Ago2基因的RNA干涉载体,通过转染家蚕细胞发现,Ago1和Ago2基因表达明显下降。并观察细胞形态发现,转染RNAi载体96h后,家蚕BmN细胞逐渐失去正常的梭形状态,体积变大,形态变圆。该研究为进一步研究家蚕中small RNA的产生及作用机制提供了较好的基础。     

气相色谱法检测水体中2，4-二氯酚的方法研究*

 采用气相色谱法对水体样品中2,4－二氯酚（2,4－DCP）的含量进行了分析与检测。结果表明,在选定的气相色谱检测条件下,2,4－DCP的保留时间为8.447 min,最小检出量为3.37×10^-10 g;当添加浓度为2.0,4.0,10.0 mg/L时,供试的2,4-DCP在水体中的添加回收率为91.32%~95.87％ ,变异系数为10.75％~14.85％。说明该方法的准确度、重现性和精确度都符合分析与检测的要求,适用于对实际样品中2,4－DCP的分析与检测。     

几种核型多角体病毒感染性的检测

通过共转染法获得重组绿色荧光蛋白GFP基因的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV,并通过检测荧光的产生来分析昆虫是否受到感染。观察多种病毒组合感染的BmN细胞,分析病毒对细胞的影响规律,从而了解不同病毒在同一宿主体内的相互作用情况。结果表明,亲缘关系较近的病毒之间更容易相互感染。该结论可以对宿主域拓展的研究提供有价值的信息。     

2,4-D和NAA对黄豆芽品质和形态的影响

在室温条件下研究不同浓度生长调节剂2,4-D、NAA对黄豆芽品质和形态影响的差异性,旨在为黄豆芽生产工作选择最适浓度的生长调节剂提供指导.结果表明,黄豆在发芽过程中,用清水处理时蛋白质含量最高,用10-9 mol/L 2,4-D处理时维生素C(VC)含量最高,用10-8 mol/L NAA处理时VC含量最高;另外使用10-8 mol/L 2,4-D处理时黄豆芽胚根长度和面积最大,使用10-5 mol/L NAA处理时黄豆芽下胚轴体积最大.     

NAA、2,4-D对崇明水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)愈伤组织的诱导及再生的不同影响

目前水仙组织培养过程中愈伤组织的诱导是一大难题.本文以带鳞片的鳞茎盘为外植体,研究了2,4-D、NAA 2种类型的生长素对水仙组织培养中愈伤组织诱导的影响.结果表明,高浓度的2,4-D (3.0～4.0 mg/L)结合6-BA能诱导无色瘤状愈伤组织,中等浓度的2,4-D (0.5 mg/L)有利于芽点的诱导和瘤状愈伤组织的增殖,而较低浓度的2,4-D (0.1 mg/L)有利于诱导出小鳞茎,也能促使瘤状愈伤组织再生成苗.而NAA结合6-BA不能诱导愈伤组织的形成.高浓度的NAA不仅诱导未分化的分生组织细胞分裂,也能促进分化的细胞进行分裂,从而使形成白色凸起状结构.另外,培养基中这2种激素互换可以使组织培养过程中形成的愈伤组织或白色突起发生相互转换.这些结果说明,水仙组织培养过程中愈伤组织的诱导和不同形态的器官发生与培养基中生长素种类和浓度关系密切.     

2,4-二叔丁基苯酚对啤酒花幼苗光合特性的影响

采用田间小区试验,研究了不同浓度2,4-二叔丁基苯酚对啤酒花幼苗光合特性的影响.结果表明,低浓度(7.5、15 mmol/m2)的2,4-二叔丁基苯酚能够促进啤酒花幼苗的光合作用,且在一定范围内随浓度的增大促进作用增强,但浓度大于15 mmol/m2时会产生化感抑制作用.2,4-二叔丁基苯酚处理后,啤酒花幼苗的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度的变化为:7.5 mmol/m2浓度处理分别较对照高11.48%、52.40%、40.70%和52.03%;15 mmol/m2浓度处理分别较对照高28.93%、119.05%、89.10%和63.16%,其中光合速率与对照差异显著(P<0.05);22.5 mmol/m2浓度处理分别较对照低34.40%、47.60%、57.18%和37.19%,其中光合速率与对照差异显著(P<0.05).啤酒花幼苗光合速率日变化呈双峰型,最高峰出现在上午9∶00左右,次高峰出现在中午13∶00左右.午间有明显的“午休”现象,相对而言,7.5 mmol/m2和15 mmol/m2浓度处理的幼苗“午休”现象不太明显,气孔因素是导致其午休的主要原因.     

生长调节剂对猴头子实体生殖生长及发育的影响

本实验用赤霉素和２．４—Ｄ分别用筛选出的最适浓度和剂量，分两次喷施于猴头幼小子实体上，处理后采收同期生长的子实体，制成石蜡组织切片，并进行显微镜观察。结果表明：与对照组相比，赤霉素和２．４—Ｄ对猴头子实体细胞的伸长，担子形成，分化和担孢子成熟有明显的促进作用，从而为其能提高猴头产量，缩短猴头生长周期提供了理论依据