禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.     

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。     

禽白血病-肉瘤病毒的RT-PCR检测

应用RT-PCR对2株禽白血病病毒（ALV）和1株劳斯肉瘤病毒（RSV）进行了检测试验.试验提取了病毒RNA,并使用3对ALVgp85基因引物对其进行了反转录、扩增,从而建立了ALV-RSV RT-PCR.使用无相关性的禽RNA和DNA病毒进行特异性试验和使用ALV进行的敏感性试验表明,该方法是一种快速、特异、敏感的体外试验,可用于禽源病毒种毒和疫苗中ALV和RSV的污染检测.     

禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立

为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值.     

间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。     

应用ELISA双抗体夹心法检测＼猪细小病毒抗原的研究

研究建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。试验方法的最侍工作条件为，抗体浓度１：４００，酶标抗体浓度１：５０。５４份胎猪样品阳性检出率为５９．３％，不同脏器的阳性检 出率分别为，心３６．４％、肝脏７２．２％、肺脏６６．７％、肾脏６６．７％。     

应用ELISA双抗体夹心法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

本试验建立了检测鸡病毒性关节炎病毒的ELISA双抗体夹心法.取代反应、阻断试验均为阴性,与NDV、MDV和IBDV无交叉反应,对已知阳性标本的检测均为阳性;其敏感性比琼扩试验高80倍以上,这表明ELISA夹心法具有较高的特异性和敏感性.在人工感染后2～27d,关节滑膜、腱鞘和脾脏中病毒检出率为100％;还从肝脏、法氏囊和脑组织中检测到病毒.     

禽白血病病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立及初步应用

以大肠杆菌表达、纯化的禽白血病病毒（ALV）重组P27蛋白为包被抗原,建立了检测ALV-P27抗体的间接ELISA方法,为禽白血病流行病学调查提供了一种简便的血清学检测方法.该方法与9种禽常见传染病病毒阳性血清及大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于10％,具有良好的重复性;新建立的ELISA方法比IDEXX公司生产的ALVA、B亚群抗体检测试剂盒和J亚群抗体检测试剂盒相对于免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率.     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ,试验方法的最佳工作条件为：抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１：２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体,脑和肺的检出率最高,其次为心,肝,脾,肾等组织。     

禽白血病病毒ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究以在毕赤酵母系统中表达并纯化的p27重组蛋白为包被抗原,HRP标记的兔抗鸡IgY为酶标二抗,建立了一种快速有效的禽蛋白血病病毒ELISA检测方法,并对其反应条件进行优化。结果显示,该方法具有良好的特异性和重复性;与市售商品试剂盒相比,符合率为96.92%,且更为敏感。应用建立的ELISA方法检测来自吉林省内鸡场314份疑似样品,阳性检出率为75.15%。本研究为禽白血病病毒的检测与诊断提供了一种简便、有效的检测方法。     

ELISA检测禽呼肠孤病毒抗体方法的建立及应用

建立了一种检测禽呼肠孤病毒(ARV)抗体的敏感方法——ELISA法。用此法对某鸡场血清样品进行检测,琼扩检出阳性率为65%,ELISA检出阳性率为100%,ELISA方法明显比琼扩敏感。另外,用ELISA方法诊断出江苏某鸡场发生的鸡病毒性关节炎,并用ELISA法筛选出8株分泌ARVMcAb的杂交瘤细胞株。ELISA方法因其特异、敏感、可靠,将成为SPF鸡群,祖代鸡群净化ARV的有效检测手段。     

禽白血病病毒自然感染及抗体变化动态规律

试验随机选取1日龄地方鸡(原种鸡)115只,带翅号。于1、7、14、21、28、38、58、68、88、98、108、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、260、300日龄按号对应采泄殖腔棉拭子进行ELISA检测禽白血病病毒p27抗原。同时按号对应翅静脉采血分离血清进行ELISA检测A、B亚型抗体和J亚型抗体。260日龄时,对全群鸡只进行病毒分离。试验结果表明,全群鸡在监测的300日龄内均有ALV感染发生。其中p27抗原检出率在7日龄时达到最低值,为2.11%;在170日龄时达到最高峰,为32.18%。从38日龄到300日龄逐渐出现ALVA、B抗体阳性鸡只,阳性率在10%左右。260日龄时阳性率达到最高峰,为30.86%。260日龄病毒分离阳性率为29.49%(23/78),略高于棉拭子p27检出率20%(16/80),二者符合率为79.49%。J亚群抗体检测均为阴性。病毒感染与抗体变化没有直接相关性。     

双抗体夹心ELISA检测牛病毒性腹泻病毒的研究

建立了从粪便中检测牛病毒性腹泻（ＢＶＤ）病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为，抗体包被量为１００μｇ／孔，酶标抗体的浓度为１：４００。对不同地区牛、羊、鹿粪样检测结果，牛的ＢＶＤＶ感染率为１６．５％￣８９．０％，羊为１４．６％￣８３．３％，鹿为１９．６％￣４４．４％，并且从许多地区的牛、羊同时检测到ＢＶＤＶ，表明本病在国内某些地区存在着严重的感染。     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为,抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高,其次为心、肝、脾、肾等组织。     

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）p27抗原ELISA检测试剂盒（国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX）进行比较。结果显示：从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2～3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品（DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪）的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。     

用单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA检测传染性法氏囊病毒

利用抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性单克隆抗体建立单抗克隆抗体夹心ELISA,本方法对16株IBDV均呈阳性反应.对人工感染和自然发病的鸡法氏囊病的检出率为100％;同时对其它脏器进行了检测,以脾和肾的检出率最高,肝次之,心和肺较低.本法对IBDV蛋白的最小检出量为7.5ng/ml,因而是一种高度灵敏、特异、简便、快速的检测IBDV的方法。