内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用

利用聚合酶链式反应(PCR)方法对细菌BEB2做进一步的分子鉴定,并研究不同温度、pH值和培养基下BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力.以及应用BEB2对香蕉枯萎病进行防治测试.结果发现,香蕉内生拮抗细菌BEB2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);不同温度、pH值和培养基下的BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力具显著差异,在King B2培养基上抑菌作用最强,最适抑菌温度为32℃,最适抑菌pH值为9.0.香蕉枯萎病盆栽防治实验结果发现,菌株接种离体叶片和植株均表现出一定的抑制活性,防治效果良好;该菌株连续20次转接培养,遗传稳定性高,抑菌谱较宽,具一定的生防应用价值.     

拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆

收集海南不同盐碱地的土样进行拮抗香蕉枯萎病菌的微生物分离,对具有较强抑菌作用的菌株进行形态特征、生理生化和分子鉴定,并克隆其抗菌蛋白基因.结果分离到1株具有较强抑制香蕉枯萎病菌能力的细菌LXl,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).抑菌实验发现LX1菌株的发酵上清液中粗蛋白有一定的抑菌作用,经过Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化了其中抑菌作用最强的抗菌蛋白.质谱鉴定结果表明,抗菌蛋白与B.amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高.根据质谱结果克隆了该抗菌蛋白的编码基因,该基因的核苷酸和氨基酸序列与B.amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达99％和100％.拮抗香蕉枯萎病菌的芽孢杆菌LX1可作为潜在的防治香蕉枯萎病的的生防制剂,其抗菌蛋白基因也可通过遗传工程应用于香蕉枯萎病的防治.     

香蕉内在拮抗细菌研究Ⅰ——菌株B215的分离及分子鉴定

在香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)重病园区,从生长正常的香蕉假茎内分离获得1株细菌,编号为B215.经对峙培养和孢子萌发抑制测定,B215对FOC和香焦其他几种主要病原菌的菌丝生长和孢子萌发具有良好抑制效果.对峙培养明显抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长,抑菌带宽度0.5-0.6 cm.菌株B215培养液滤液使香蕉枯萎病菌孢子和菌丝生长点膨大成球状畸形,原生质外泄,细胞崩溃十瘪,其EC50为4.12%.形态学、生理生化试验显示B215为芽抱杆菌(Bacillus);进一步对该菌株做16srDNA序列测定与分析,表明其与已报道的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Strain KL-073)具有100%的同源性,二者所构建的系统发育树上处于同一个分支.将B215鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis).     

2种激发子对西瓜枯萎病的诱抗作用

分别测定了来源于西瓜枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的细胞壁来源的水溶性、热稳定激发予对西瓜枯萎病的诱抗作用。结果表明：2种来源的激发子均有明显的诱导西瓜苗细胞壁木质化的作用，但来源于香蕉枯萎病菌的激发子对木质化的诱导活性比来源于西瓜枯萎病菌的要高；西瓜苗分别经2种激发子处理后，体内过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氮酶的活性均有异常的增加，但来源于西瓜枯萎病菌的激发子对这3种防御酶的诱导速度比来源于香蕉枯萎病菌的要快；经激发子诱导处理后瓜苗对枯萎病菌的抗性有了明显的提高，但来源于西瓜枯萎病菌的激发予的诱抗效果相对较好。     

128种南药植物提取物对6种病原菌的生长抑制作用

以水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、香蕉枯萎病菌[(Fusarium oxysporum sp.cubense(E.F.Smith)Syn.et Han)]、香蕉炭疽病菌[Colletotrichum musae(Berk&Curt)Arx]、杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides PenZ)、辣椒炭疽病菌[Colletotrichum capsici(syd.)Butl.]和西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)6种病原菌为供试菌种,对47科128种南药植物的丙酮提取物进行室内抑菌活性试验。结果表明:有36种植物提取物对6种病原菌菌丝生长抑制率在60%以上;22种植物提取物对至少4种病原菌菌丝生长抑制率在80%以上;经方差分析,荜茇、艾纳香、白背叶、香茅、阴香、九里香、花椒、高良姜、益智、山柰、姜等11种植物提取物的抑菌效果与化学农药0.5mg/mL施保功的抑菌效果差异不显著。      

香蕉嗜铁内生细菌BEB99的分离鉴定及其抗病促生能力评价

从健康的香蕉根组织内分离获得一株对香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）有拮抗作用的内生细菌菌株BEB99，经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析等方面的研究，鉴定该菌为劳尔氏菌（Ralstonia sp.）。铁载体检测结果发现，该菌株属于极高产铁载体菌株。盆栽试验结果表明，该菌株对香蕉枯萎病的防治效果达62.52％，并对香蕉植株具有显著的促生作用。     

枯草芽孢杆菌B215生物学特性及对香蕉枯萎病的生防效果评价

在室内测定菌株B215对香蕉枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发都有良好抑制效果的基础上,优化拮抗菌株的最佳培养条件为:在NA培养基上,装液量为50mL/500mL,最适初始pH值为7.0～7.5,初始接菌量为1%,培养温度为28℃,以便更好地应用于田间试验。以此培养条件为依据,开展拮抗菌株的盆栽小苗实验,选用正交试验L8(27)设计,得出菌株B215对香蕉枯萎病菌的最佳防效组合为:在小苗定植前,用活菌培养液750mL/株浸根,可以降低小区香蕉枯萎病发病率。进一步试验验证结果显示:盆栽试验B215对Foc的防效为62.95%。     

一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基

为探寻在非无菌操作下能从土壤中快速且大量分离检测香蕉枯萎病菌,研制了一种用于检测香蕉枯萎病病原菌的选择性培养基-PCEA,其成分为:马铃薯200 g,CuSO_4·5H_2O 0.5 g,MgSO_4·7H_2O 0.6 g,KH_2PO_4 0.1 g,敌克松结晶粉(75%)3 g,硫酸链霉素0.75 g,95%酒精10mL,水1 000mL,pH5.8,琼脂18～20g.该培养基与其它常见分离培养基相比,无需无菌操作,且成分简单、检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性培养基.     

一株拮抗香蕉枯萎病菌的细菌HN-1的鉴定和拮抗作用的测定

在香蕉枯萎病园区中,从土壤中分离获得一株细菌HN-1,并进行对峙培养、孢子萌发抑制测定。结果表明：HN-1对香蕉枯萎病菌的菌丝生长、孢子萌发具有良好的抑制效果。经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列测定和分析,将HN-1鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株对供试的15种植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

香蕉枯萎病病原菌Six同源基因的鉴定

为鉴定香蕉枯萎病病原菌Six同源基因，通过BLASTP分析从香蕉枯萎病病原菌1号生理小种菌株N2基因组中鉴定了Six1和Six6同源基因，从4号生理小种B2菌株基因组中鉴定了Six1、Six2、Six6和Six8同源基因。采用PCR扩增从亚热带4号生理小种菌株基因组DNA中扩增到Six7同源基因，并从其它一些1号和4号生理小种菌株基因组DNA中也扩增到了Six2和Six8同源基因。上述结果表明，不同古巴专化型菌株Six基因组成可能不同。该研究结果为进一步研究香蕉枯萎病病原菌Six基因的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌及其粗毒素对香蕉的致病性比较

从8种培养液中筛选出能诱导香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)FOCAAA315菌株高产毒素的改良CzapekB培养液,FOCAAA315菌株在该培养液中培养第15d,镰刀菌酸(FA)产量高达669.2mg/L,蔗糖为诱导产毒的最佳碳源。采用伤根浸渍法接种,测定枯萎病菌和病菌发酵粗毒素对香蕉组培苗的致病性。结果表明,粗毒素接种可诱发与病原菌类似的病害症状。受侵染的植物组织在细胞水平上发生一系列形态结构和生理生化代谢的病理变化,包括细胞壁消解、侵填体堵塞气腔、粘胶质减少、淀粉量减少、细胞木质化和黄褐色胶状物堵塞导管等。香蕉枯萎病菌的粗毒素是重要的致病化学物质;利用病菌孢子悬浮液在香蕉苗期接种,可以作为室内快速鉴定香蕉品种抗病性的方法。     

抑制尖孢镰刀菌人工肽适体的筛选和鉴定

香蕉枯萎病严重危害香蕉产业的发展。本研究从肽适体文库中筛选获得对香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌有抑制作用的人工肽适体SNP-D4。通过构建人工肽适体体外重组表达载体,获得SNP-D4体外重组蛋白。结果表明,通过抑菌活性检测表达人工肽适体SNP-D4的大肠杆菌全蛋白提取液,能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发,使其萌发率降低至19.60%。本研究筛选得到的人工肽适体SNP-D4可应用于研发环境友好型特异抗真菌生物制剂,为香蕉枯萎病防治提供新的技术手段。     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

锡兰肉桂无水乙醇提取物的抑菌活性

采用菌丝生长速率法和组织测定法,测定锡兰肉桂无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌和芒果蒂腐病菌的抑菌活性以及20%锡兰肉桂微乳剂对胡椒瘟病的保护作用。结果表明,锡兰肉桂无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌具有较好的抑菌活性,在浓度1.5 mg/mL时抑菌率为91.94%,EC50为0.687 5 mg/mL;对芒果炭疽病菌的抑菌率为63.75%,但对芒果蒂腐病菌无抑菌活性。20%锡兰肉桂微乳剂对胡椒瘟病表现出较好的保护效果,当稀释100倍和50倍时抑制率分别为72.79%和78.91%。     

香蕉枯萎菌原生质体形成与再生条件

通过对菌丝菌龄、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一种制备香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)原生质体的有效方法,并在固体再生培养基上实现了原生质体的再生,再生率为22.5%。     

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。     

不同香蕉品种根系分泌物对香蕉枯萎病致病菌的影响及组成分析

从根系分泌物角度阐释不同香蕉品种对香蕉枯萎病的抗(耐)性机理,通过离位溶液培养法收集对香蕉枯萎病抗(耐)性不同的3个香蕉品种‘GCTCV-119’、‘桂蕉9号’和‘桂蕉1号’的根系分泌物,测定其根系分泌物对香蕉枯萎病致病菌的菌落生长和孢子萌发的影响,并分析其根系分泌物中游离氨基酸、可溶性总糖、有机酸的含量。结果表明,抗(耐)病品种根系分泌物抑制香蕉枯萎病致病菌的菌落生长和孢子萌发,而感病品种根系分泌物则促进香蕉枯萎病致病菌的菌落生长和孢子萌发。抗(耐)病品种根系分泌物中,可溶性总糖及游离氨基酸含量明显低于感病品种,有机酸含量则比感病品种高。3个香蕉品种中,共检测到13种氨基酸。其中,甘氨酸、谷氨酸、胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸仅在感病品种‘桂蕉1号’中检测到;苯丙氨酸和脯氨酸只在抗(耐)病品种‘GCTCV-119’和‘桂蕉9号’中检测到。     

一株香蕉拮抗内生细菌的分离及鉴定

从健康的香蕉组织内分离获得22株内生细菌,从中获得1株对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense）1号与4号小种具有抑制作用的拮抗菌(编号为BEB9）,经形态学、生理生化及16S rDNA序列鉴定等方面研究,确认为伯克霍尔德菌。研究还发现NA和YE培养基是其抑菌作用最适培养基。