番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

番茄XRN2基因的克隆、表达分析及遗传转化

为了研究番茄XRN2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄各组织混合cDNA中扩增了番茄XRN2基因全长编码序列,并对其进行了表达模式分析。结果表明该基因在番茄根部表达最强烈。通过对番茄叶片进行伤害诱导处理,发现番茄XRN2基因表达呈上升趋势。将该基因在组成型启动子CaMV35S驱动下定向构建至植物表达载体pCambia1301-35S,重组载体命名为pCambia1301-35S-XRN2和pCambia1301-35S-AsXRN2。通过农杆菌介导法转化获得转基因番茄,为进一步阐明XRN2基因在番茄中的功能奠定了基础。     

番茄NAM基因的克隆与遗传转化

为了研究番茄NAM基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄cDNA中分离了NAM(GenBank登录号:FJ435163.1)基因,该基因ORF全长1 053 bp,共编码351个氨基酸,N端含有NAC结构域.定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花和果实中均有较强表达.为了进一步研究番茄NAM基因的功能,构建了NAM基因的超表达载体pLP100-35S-NAM,通过农杆菌介导法转化番茄,并获得抗性植株.经表型分析,转基因番茄植株矮小,生长受到抑制,叶片形态异常,表明NAM基因影响番茄顶端分生组织(SAM)的形成和叶片形态的发生.     

转酸性蛋白酶pepB基因玉米的分子鉴定与农艺性状分析

通过分子生物学技术把酸性蛋白酶pepB基因转入受体玉米自交系基因组中,培育转酸性蛋白酶pepB基因玉米新品系。以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对T1、T2、T3代转基因植株进行PCR检测,得到14个T1代转基因阳性植株,32个T2代转基因阳性植株和27个T3代转基因阳性植株。Southern杂交结果表明,外源酸性蛋白酶基因已经整合进玉米基因组中。RT-PCR结果表明,酸性蛋白酶基因在受体玉米中获得表达,获得外源酸性蛋白酶pepB基因遗传表达的T3代转基因玉米株系。通过对T2、T3代转基因玉米各品系农艺性状的分析结果表明,转基因玉米各品系在株高、茎粗、穗长等农艺性状上与受体亲本没有差异,但生育期均有不同程度的缩短。     

番茄CYP71基因的克隆及其功能的初步分析

分析番茄的EST数据库,获得一条在番茄果实中表达的EST序列CYP71,通过RT-PCR分析表明,该基因在番茄的叶、花、果实中均有表达,其中幼果中表达最强,并受到乙烯的负调控,推测可能与果实的发育成熟相关.进而通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法获得了全长为1 637 bp的番茄CYP71基因(GenBank accession No.GQ370622).该片段包括一个完整的开放阅读框(1488 bp),编码495个氨基酸.通过系统进化树分析,属于CYP71家族.将番茄的CYP71基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,获得CYP71基因的正、反义植物表达载体pBI121-CYP71s和pBI121-CYP71as,为深入研究该基因的功能奠定基础.     

过氧化物酶基因TaPRX-2A调控小麦穗部性状的功能分析

为研究过氧化物酶基因 TaPRX-2A在调控小麦穗部性状中的功能,以苏麦3号为材料,通过Ensemblplants数据库获得 TaPRX-2A全长cDNA序列,利用PCR方法克隆获得该基因编码区全长序列。生物信息学分析结果表明,该基因包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸。进一步构建基因过表达载体 TaPRX-2A-PC186,通过基因枪介导的遗传转化方法将 TaPRX-2A-PC186转入小麦KN199中,创建过表达 TaPRX-2A转基因株系,调查 TaPRX-2A基因对转基因株系穗部性状的影响。结果表明,过表达 TaPRX-2A转基因株系的穗长显著变短,穗粒数显著减少,说明 TaPRX-2A在调控小麦穗部发育过程中具有重要的作用。     

苎麻纤维发育相关基因FB27表达与纤维细度相关研究

利用半定量RT-PCR技术研究了纤维蛋白FB27基因在不同组织、不同基因型和不同时期的茎皮中的表达情况.结果表明,苎麻FB27基因的表达不具有组织特异性,但在苎麻纤维组织高度发达、纤维组成成分最多的茎部表达量最高,尤其是茎皮;在高纤维细度种质中相对表达量较高,在低纤维细度种质中相对表达量较低;在不同的生长季FB27基因的相对表达量为:头麻>三麻>二麻.在同季麻不同生长发育时期,伸长增粗期FB27基因的相对表达量较高,苗期和工艺成熟期较低.苎麻纤维发育相关基因FB27的表达程度与纤维细度表现出正相关.     

番茄SlARF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析

为了分析Sl ARF2基因在番茄生长发育过程中的功能,利用定量PCR技术分析Sl ARF2基因的表达模式,发现Sl ARF2基因在番茄花芽中表达量最高,在幼果中次之,说明Sl ARF2基因可能在番茄花果发育中起着重要作用。为进一步研究Sl ARF2的功能,构建Sl ARF2基因超表达、抑制表达载体,农杆菌介导转化番茄成功获得了相应转基因植株。通过与野生型番茄植株花、果不同时期的表型进行比对分析,发现Sl ARF2基因的超表达对花的形态学特征无明显影响,但能够显著提高植株的结实率、降低果实大小和重量。说明Sl ARF2基因参与调控番茄花、果发育过程。     

利用转基因技术初步鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能

本研究利用前期抑制差减杂交技术筛选获得的香蕉果实上调表达的基因片段,经NCBI比对,表明该基因片段属于香蕉ATP依赖的RNA解旋酶(Helicase)基因家族成员,含有完整的RNA解旋酶超家族C-末端结构域HELICc结构。经Southern杂交证实,此RNA解旋酶基因在香蕉基因组中只有一个拷贝。构建RNA解旋酶基因的反义基因植物表达载体PBIPC86,转化番茄获得6株转基因番茄植株。转基因番茄植株的叶、花和生长形态均有变异,部分转基因番茄生长势弱。该研究结果对鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能奠定了初步基础。     

番茄SlAGO7基因的克隆及表达分析

根据番茄基因组数据库中AG07的EST序列信息,利用RACE和PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆S/A G07的cDNA全长序列和基因组序列,用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用Real-time PCR分析S/AG07在整个生长与发育过程中的时空表达模式.结果表明,SlAG07的cNDA全长片段为3 238 bp(GenBank登录号:JX467714),含有3 003 bp的完整开放阅读框,编码1 000个氨基酸,共包含3个外显子和2个内含子.所编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与已报道的AGO7蛋白序列有较高的同源性;SlAG07基因属于AGO蛋白家族中ZIPPY/AG07亚族.SlAG07在营养组织叶中微弱表达,主要集中在根和茎表达；而在生殖器官花中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势,但在果实不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达.由此推测,SlAG07蛋白可能与番茄花器官的发育相关.这为进一步研究该基因通过ta-siRNA干扰途径来调控番茄花器官发育形成的分子机制奠定了基础.     

转异苞滨藜BADH基因玉米高世代株系苗期外源基因表达及耐盐性功能分析

以转来自耐盐植物异苞滨藜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)玉米T8代株系BZ-136及受体对照自交系郑58(耐盐)为试材,采用盆栽种植方法,分析转基因植株中外源基因的表达情况,检测耐盐相关生理指标。结果表明,转基因株系BZ-136中的BADH酶活性及甜菜碱含量显著高于受体对照,随着盐胁迫时间的延长,其表达量先增加后减少,在胁迫7 d时分别达到了最大值。转基因株系幼苗株高和干重从盐胁迫第3天开始显著高于对照,鲜重和含水量在胁迫第5天和第7天时转基因株系显著高于对照;转基因株系根总体积显著高于对照,直径和根尖数在胁迫第5天时显著高于对照;转基因株系电导率和丙二醛含量均低于对照,分别在胁迫第3天和第7天开始达显著差异,叶绿素含量高于受体对照,从第3天开始二者差异达显著水平。由于外源BADH基因的表达显著提高了基因株系的耐盐性。     

茶树谷胱甘肽过氧化物酶编码基因CsGPX1功能分析

为明确茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.]谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases,GPX)编码基因CsGPX1的功能,本文利用茶树转录组数据克隆获得CsGPX1的编码区全长序列,进行序列比对与分析,在此基础上,将CsGPX1在烟草中进行过表达获得转CsGPX1基因烟草,并比较野生型烟草与转基因烟草耐旱性的差异,验证CsGPX1功能。序列分析表明,CsGPX1编码序列(CDS)长723 bp,编码240个氨基酸。BLAST比对发现,该基因与桃树(Prunus persica)的GPX基因具有高度同源性(>85%)。CsGPX1编码的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列和区别于其他家族成员的特有的结构域——磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPX)。干旱胁迫处理结果显示,过表达CsGPX1烟草株系抗旱性强于野生型。GPX酶活性测定结果表明,转基因植株的GPX酶活性高于野生型植株。以上研究结果表明,过表达CsGPX1可提高转基因烟草的耐旱能力,说明CsGPX1可能与茶树的耐旱性能相关。本研究为提高茶树的耐旱性能研究提供了新的理论途径,并对降低茶园管理的成本具有一定的积极意义。     

Proteomic Analysis of Tomato (Lycopersicum esculentum var. cerasifarm) Expressing the HBsAg Gene by 2-dimensional Difference Gel Electrophoresis

In a previous study, an HBsAg gene-bearing transgenic tomato line was made available and it exhibited notable physiological alterations compared with the non-transgenic tomato (control). In particular, leaves of the transgenic plants were fleshy and dark. We hypothesized that a change in leaf proteins of the transgenic plants account for the observed phenotypes. In this study, total protein content in leaves of the transgenic plants was analyzed by 2-dimensional difference gel electrophoresis. A total number of 700 protein spots were detected on silver-stained gels, of which 368 protein spots were matched between the control and sample gels. Among these matched proteins, the expression levels of 122 proteins in the transgenic plants were upregulated while those of the rest were downregulated. In addition, 25 abundant proteins (value ratio?>?2.0) on silver-stained gels were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Sixteen differentially expressed proteins were identified, of which 13 were predicted to be involved in cell division, energy metabolism, protein synthesis and processing. The possible roles of these proteins in the transgenic tomato strain have been discussed. Taken together, our data indicate that significant alterations in protein expression occur in transgenic tomatoes bearing the HBsAg gene. Our findings will help broaden our knowledge of the mechanism by which exogenously expressed genes lead to phenotypic alterations in transgenic plants.     

耐盐碱转基因玉米的获得及其抗性分析

依据Gen Bank数据库中发表的拟南芥DREB基因序列进行优化,人工合成DREB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将DREB基因转入玉米自交系Hi II中,获得转DREB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在不同浓度水平的Na Cl溶液(40、80、120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(10、20、30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明,DREB基因已经整合到玉米基因组中,转DREB基因玉米的耐盐碱性获得显著提高,80 mmol/L的Na Cl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转DREB基因玉米的耐盐碱分析条件。     

利用RNAi方法构建MS26基因雄性不育植物表达载体及农杆菌介导玉米遗传转化研究

应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。     

延缓叶片衰老ZmIPT2基因的玉米遗传转化及功能验证

从玉米自交系郑58中克隆Zm IPT2基因并构建单子叶植物表达载体,通过农杆菌侵染萌动胚方法将其转入玉米自交系K10中,对转基因后代进行分子检测和功能验证。结果表明,Zm IPT2基因c DNA全长969 bp,成功构建其单子叶植物表达载体p CAMBIA5300-ubi-Zm IPT2。农杆菌侵染萌动胚法共转化K10种子5 163粒,获得T0代PCR阳性幼苗48株,其中13株结实收获种子;获得的3个T2代株系PCR阳性率符合3∶1的分离比,且RT-PCR检测呈阳性;2个T2代转基因株系的成熟期叶绿素含量和细胞分裂素含量极显著高于对照,相对绿叶面积和叶面积持绿期极显著或显著高于对照,百粒重和小区产量显著高于对照。结果初步证明,Zm IPT2基因在玉米中的过表达可延缓叶片衰老,提高玉米产量。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.     

Resistance levels and fitness of glufosinate-resistant transgenic sweet potato in field experiments

Transgenic herbicide-resistant sweet potato plants [Ipomoea batatas (L.) Lam.] produced through a biolistic transformation were used in this study. The objectives of this research were to (a) quantify resistance levels of transgenic sweet potato expressing the bar gene to glutamine synthetase (GS)-inhibitors, glufosinate and methionine sulfoximine, protoporphyrinogen oxidase (PPO)-inhibiting herbicide, oxyfluorfen and photosynthesis-inhibiting herbicide, paraquat; (b) compare the relative chlorophyll content, quantum yield, growth, and tuberous root yield between transgenic and wild-type sweet potato; (c) compare the response of transgenic and wild-type sweet potato plants to chilling and high temperature, and (d) compare amino acids, minerals and sugar contents of transgenic and wild-type sweet potato tubers. The transgenic sweet potato lines were 20-82-fold more resistant to glufosinate than the wild-type. The representative transgenic line 7171 also showed resistance to methionine sulfoximine, but was not resistant to oxyfluorfen and paraquat, which have different target sites. The stem length, number of leaves, petiole length, shoot fresh weight, and storage roots of transgenic lines were lower than those of the wild-type in field experiments. Reduced growth and root yield were not due to reduced quantum yield and relative chlorophyll contents. Glufosinate increased the ammonium accumulation in leaves of wild-type plants, but had minimal or no effect on leaves of transgenic line 7171. There were differences in mineral contents, free sugars, total amino acids, and free amino acids in the petiole and storage roots between wild-type and line 7171. There was no difference in drought tolerance between wild-type and line 7171, but the transgenic line was more tolerant to chilling temperature than wild-type plants. Follow-up research is required to elucidate the mechanisms underlying the growth and yield differences, different nutritional values, and differential response to low temperature between wild-type and transgenic sweet potato.