PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb.测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及白激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中，构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb。测序正确后，将重组质粒导入YRG-2酵母菌株，检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明，获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中，且转化有诱饵载体的YRG-2在SD／Trp营养缺陷甲板上生长良好，说明表达产物对酵母细胞无毒性，对报告基因也无自激活作用，为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

以克隆到的3个编码橡胶树14-3-3蛋白的基因HbGF14a、HbGF14b、HbGF14c和为基础,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbGF14a、pGBKT7-HbGF14b、pGBKT7-HbGF14c,并对其进行自激活和毒性实验鉴定.自激活实验结果表明,3个诱饵载体没有自激活性;毒性实验结果表明,pGBKT...     

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端（Pc2-N）与Pc2 C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上，并构建水稻叶片cDNA文库，然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明，诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力，但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL，且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库，获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明，这些克隆共编码5种蛋白，主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及白激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白（CP、HC-Pro、CI）互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选。通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响。结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×10⁶ CFU,转化效率为9.15×10⁵ CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×10⁸/mL,文库滴度为2.22×10⁷CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。     

甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定

甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子,在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用,但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一,因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的机制,本研究首先将SCSMV P1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1,然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测,最后以pGBKT7-P1为诱饵,采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示,成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2H Gold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好,表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2H Gold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长,表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选,经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后,获得42个阳性酵母克隆,提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养,经测序及blastx比对分析,获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白,分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15,转录因子NAC、GATA4、OFP4,真核翻译起始因子eIF5A,分子伴侣DnaJ,辅分子伴侣SBA1,重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2,外膜孔蛋白OEP24,及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能,推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达,和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运,从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。     

暹罗炭疽菌转录因子CsAtf1互作蛋白的筛选和鉴定

碱性亮氨酸拉链bZIP是真核生物转录因子家族之一,通过调控基因的表达来参与调控生长发育及生物、非生物胁迫应答等生理过程.已有报道表明bZIP转录因子Atf1与多种病原真菌的生长发育及致病力相关.由于转录因子通常能够在其他互作蛋白的参与下与顺式作用元件特异性结合,从而调节靶基因表达,因此筛选其互作蛋白对深入了解转录因子的...     

Screening of Rice Genes Interacting with p5b of Rice BlackStreaked Dwarf Virus

Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) is a recognized member of the genus Fijivirus,family Reoviridae.Its genome has ten double-stranded RNA (dsRNA) segments (S1-S10),in which the fifth genome segment (S5) contains two open reading frames (ORFs) with a partially overlapping region.The second ORF of RBSDV S5 encodes a viral nonstructural protein named p5b with unknown function.To reveal the function of p5b,its gene was ligated into the bait plasmid pGBKT7 and an expression library containing rice cDNAs was constructed using plasmid pGADT7 for yeast two-hybrid assay.The bait protein p5b was detected in yeast by western blot,and the result of an auto-activation test showed that p5b could not autonomously activate the expression of reporter genes in yeast.Then the bait protein p5b was used for screening the cDNA expression libraries of rice.Gene fragments of some pivotal enzymes involved in photosynthesis,respiration and other important metabolic processes,were identified to interact with p5b in yeast,suggesting that these interactions may play roles in symptom development in infected plants.     

水稻瘤矮病毒 P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12 的酵母双杂交载体的构建及自激活效应检测

将编码水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的S3,S7,S8,S9,S10,S11和S12基因分别克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中,转化AH109酵母细胞,结果显示:除pGBK-S10转化子可以在SD/-Trp和SD/-His营养缺陷固体培养基上正常生长外,其它转化子均只能在SD/-Trp或SD/-Leu营养缺陷固体培养基上正常生长.通过α-半乳糖苷酶活性分析揭示,除pGBK-S10可以在SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长并变蓝外,其它均不变蓝.结果证实:RGDV Pn10在酵母细胞中具有转录激活活性,融合GAL4的RGDV Pn10蛋白可以在酵母细胞内激活HIS3和MEL1报告基因的表达.暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达.