橡胶树AtCAB1同源基因的克隆及其在稳定与衰老期叶片中的差异分析

以一编码蛋白与拟南芥的CAB1高度相似的EST序列作为探针,通过同源搜索从橡胶树的转录组数据中电子克隆到一条长1 415 bp的cDNA,该序列包含一798 bp的ORF及47 bp的5′UTR和570 bp的3′UTR,命名为HbCAB1;在此基础上,采用PCR技术成功扩增了包括该ORF在内的915 bp的cDNA序列。序列分析表明,该基因预测编码265个氨基酸,理论分子量为28.15 ku,等电点为5.25;蛋白含有1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,3个跨膜螺旋和1个C端螺旋,1个三聚化基序,     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

早钟6号枇杷两个ETR基因成员的克隆及序列分析

以早钟6号枇杷的试管苗叶片为材料,采用同源克隆方法得到乙烯受体基因ETR的两个成员Ej-ETR1a和Ej-ETR2a的cDNA全长序列,在GenBank上的登录号为JX307084和JX307089.Ej-ETR1a序列全长2771 bp,包括227bp 5’-UTR、2226 bp ORF及318 bp 3’-UTR; Ej-ETR2a序列全长2594 bp,包含2226 bp ORF及366 bp 3’-UTR.Ej-ETR1a、Ej-ETR2a均编码741个氨基酸,且氨基酸序列具有95.28％的相似性.生物学信息分析表明:枇杷Ej-ETR1a和Ej-ETR2a均属于乙烯受体ETR1亚家族,为一个具有跨膜结构的非分泌蛋白,具有疏水性.2个ETR成员的克隆为进一步研究枇杷乙烯受体作用机制奠定了基础.     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒(BSV)全基因组为模板，PCR扩增得到了带有GatewayR重组反应接头序列的香蕉条斑病毒ORFⅠ及ORFⅡ基因片段，经过BP、LR重组后，构建成带有目的片段的酵母双杂诱饵质粒pDEST32-O1及pDEST32-O2。将质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选序列和编码框均正确的重组质粒。将以上2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒的pDEST22空质粒共转化酵母MaV203感受态细胞，利用营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp)筛选转化子，并对转化子进行毒性鉴定、自激活鉴定以及3-AT抑制浓度鉴定。结果显示，2种转化子均生长正常，说明所构建的2个重组质粒表达蛋白对酵母无毒性作用，其在特异营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp-Ura)中无法生长，不能产生自激活现象，3-AT抑制浓度分别为50、75 mmol/L。以上结果说明所构建的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作，为BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础。     

一个木薯候选STK类抗病基因的分离及其生物信息学分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板,通过PCR扩增,均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列,比对发现,木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测,获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因,命名SSK1。序列分析表明,该基因编码621 aa,有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域,具有典型的STK类抗病基因的保守结构,是一个候选的抗病基因,可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。     

橡胶树铜转运蛋白基因的克隆及在健康树与死皮树中的差异表达

铜转运蛋白(Copper transporter,COPT)属于CTR/COPT铜转运家族,参与调节生物体内铜的动态平衡。根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbCOPT5基因的全长cDNA序列,其ORF长420 bp,共编码139个氨基酸,预测HbCOPT5蛋白分子量为15.67 ku,等电点为5.26,含有3个跨膜区。进化树分析结果表明,HbCOPT5与蓖麻、杨树中的COPT蛋白亲缘关系最近;在拟南芥的6个COPT蛋白中,与AtCOPT5的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,健康植株中HbCOPT5的表达量是死皮树中的2.8倍。     

大豆HB基因GmSbh1的分离与生物信息学分析

从大豆叶片中分离到Gm Sbh1基因c DNA的完整开放阅读框(ORF)序列,对其编码的氨基酸序列、蛋白质一级、二级结构及互作蛋白等进行了生物信息学分析。结果表明:在Gm Sbh1基因c DNA序列的第156~1 293 bp处有一个完整的ORF,编码379个氨基酸;Gm Sbh1具有同源异型盒(homeoboxbox,HB)基因家族典型的KNOX1、KNOX2、ELK和Homeodomain(HD)结构域;检索到18条与Gm Sbh1核酸序列一致性大于80%的序列;Gm SBH1为亲水性蛋白,不具有信号肽,分子量为42.37 k Da,其中丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asn)和亮氨酸(Leu)分别为占10%、9.8%和8.4%,可能发生磷酸化的位点分别在Ser(13个)、酪氨酸(Tyr)(2个)和苏氨酸(Thr)(1个)上;二级结构预测结果显示,Gm SBH1序列存在α-螺旋(占39.31%)、β-转角(占5.28%)、延伸链(占8.44%)和无规则卷曲(占46.97%),不存在跨膜螺旋;蛋白互作预测表明,Gm SBH1与拟南芥中的RPL、BEL1、AT4G32980.1-P、BLH2和BLH3等蛋白的互作程度较高,其中与BEL1共表达的几率较高。     

野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

水稻柠檬酸合酶编码基因的初步研究

 以粳稻cDNA为模板，设计一对特异性引物，获得编码水稻柠檬酸合酶基因的cDNA序列，全长为1470 bp，ORF区含475个氨基酸，推定蛋白序列与红葡萄、烟草、甜菜、拟南芥和柑橘等物种都有较高的同源性（>70％），氨基末端含一线粒体靶信号。Southern分析表明此基因在水稻基因组中具有多个拷贝数。经0.4 mmol/L IPTG诱导,根据Western印迹分析获得预测的蛋白大小为59 kD。     

Albumin and Globulin Proteins of Wheat Flour: Immunological and N-terminal Sequence Characterisation

Several non-storage proteins are encoded by genes on individual wheat chromosomes and these have been used as genome-specific markers. In this study, a library of monoclonal antibodies with differing specificities to water- and salt-soluble proteins has been developed in order to obtain markers for different wheat chromosomes. Two antibodies, BCSAU 9D1 and JGM 1B4 were found to bind polypeptides encoded by chromosomes 3D and 4D respectively. Other antibodies bound to small numbers of polypeptides encoded by more than one chromosome, such as 5A, 7D, 5B and 5D. The proteins recognised by some of the antibodies were isolated by immunoaffinity chromatography, and one protein was identified as an alpha -amylase inhibitor by N-terminal sequence characterisation. In addition, 16 water-soluble and eight salt-soluble proteins were isolated using SDS-PAGE, isoelectric focusing, two-dimensional electrophoresis and reversed-phase high performance liquid chromatography, with the main objective being to confirm the identity of particular proteins, especially those which were able to be assigned to particular chromosomes. The N-terminal sequencing characterisation identified 19 proteins, whereas four proteins were found to be blocked and one did not match with any proteins in the database. Most of the water-soluble proteins belonged to a family of alpha -amylase inhibitors. One protein, assigned to chromosome 4BS, was homologous to serine carboxypeptidase III. N-terminal sequences of some of salt-soluble proteins matched with internal sequences of barley embryo globulin. Other proteins were identified as lipid transfer protein, peroxidase BP-1 precursor and histone H4 proteins. The protein sequences could also potentially be used for making antibody or DNA probes for use in selection in breeding programmes.     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白(GOBP)的基因克隆与序列分析

以触角总RNA为模板,根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR扩增结合RACE技术克隆获得了茶尺蠖(Ectropis obliqua)普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2基因的cDNA全长序列。分别命名为EoblGOBP1和EoblGOBP2。EoblGOBP1的cDNA全长为1 528 bp,开放阅读框501 bp,编码166个氨基酸残基,预测分子量Mw=18 835.63 D,等电点pI=5.45,cDNA和氨基酸序列在NCBI/GenBank的登录号分别为FJ156732和ACN29680.1。EoblGOBP2的cDNA全长为1 315 bp,开放阅读框405 bp,编码160个氨基酸残基,预测分子量Mw=18 002.75 D,等电点pI=5.32。cDNA和氨基酸序列在NCBI/GenBank的登录号分别为FJ156733和ACN29681.1。两个气味结合蛋白的氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征,与已报道的鳞翅目昆虫气味结合蛋白的同源性为分别62%～82%和76%～88%。     

大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因的克隆及其原核表达载体的构建

利用RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增大豆GlY m Bd 30K的完整开放阅读框,与pET一28a载体连接,构建原核表达载体.结果表明:克隆了大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因,且构建了其原核表达载体.该基因含有长度为1 140 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为42 758,等电点为5.08.序列同源性分析发现其与数据库中已知的Gly m Bd30K基因同源性很高,因此认为其是大豆的过敏原基因,在GenBank数据库中的登录号为EU883600.克隆的大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因及构建的原核表达载体,为大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的重组表达和免疫活性鉴定等奠定基础.     

暹罗炭疽菌转录因子CsAtf1互作蛋白的筛选和鉴定

碱性亮氨酸拉链bZIP是真核生物转录因子家族之一,通过调控基因的表达来参与调控生长发育及生物、非生物胁迫应答等生理过程.已有报道表明bZIP转录因子Atf1与多种病原真菌的生长发育及致病力相关.由于转录因子通常能够在其他互作蛋白的参与下与顺式作用元件特异性结合,从而调节靶基因表达,因此筛选其互作蛋白对深入了解转录因子的...     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

巴西橡胶树CBF1基因的克隆和序列分析

通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了CBF基因家族的保守区,并通过5＇端RACE和3＇端RACE技术克隆了全长为1121 bp的cDNA序列,通过BLAST工具搜索Genbank数据库.结果表明,该cDNA序列同其他植物中的CBF家族基因高度同源,认为该cDNA序列就是橡胶树中的CBF基因.利用genescan和ClastalX工具对该序列进行分析,推测其编码区为693bp,编码231 Aa,并包含一个AP2 DNA结合域.氨基酸同源性分析结果表明,来自橡胶树的CBF基因氨基酸序列与热带起源的作物同源性较高,而与北方种植作物相似性较低.     

Screening of Rice Genes Interacting with p5b of Rice BlackStreaked Dwarf Virus

Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) is a recognized member of the genus Fijivirus,family Reoviridae.Its genome has ten double-stranded RNA (dsRNA) segments (S1-S10),in which the fifth genome segment (S5) contains two open reading frames (ORFs) with a partially overlapping region.The second ORF of RBSDV S5 encodes a viral nonstructural protein named p5b with unknown function.To reveal the function of p5b,its gene was ligated into the bait plasmid pGBKT7 and an expression library containing rice cDNAs was constructed using plasmid pGADT7 for yeast two-hybrid assay.The bait protein p5b was detected in yeast by western blot,and the result of an auto-activation test showed that p5b could not autonomously activate the expression of reporter genes in yeast.Then the bait protein p5b was used for screening the cDNA expression libraries of rice.Gene fragments of some pivotal enzymes involved in photosynthesis,respiration and other important metabolic processes,were identified to interact with p5b in yeast,suggesting that these interactions may play roles in symptom development in infected plants.