稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

稻瘟病菌假定几丁质酶家族基因的表达特点

在稻瘟病菌基因组数据库中检索到15个假定几丁质酶相关基因,借助生物信息学分析,发现这些几丁质酶均具有糖苷水解酶18家族结构域,有的还具有几丁质结合功能域;亚细胞定位分析表明,8个编码蛋白定位在细胞外,其余分别定位在细胞质和线粒体。通过与酵母几丁质酶CTS1与CTS2的聚类分析,发现这些假定几丁质酶可以分为2大类,其中11个假定几丁质酶与CTS2聚为一类,即CTS2同源蛋白;其余4个与CTS1聚为一类,即CTS1同源蛋白。在此基础上,本研究进一步通过Real-time PCR技术分析这些假定几丁质酶编码基因在稻瘟病菌菌丝生长、孢子形成、芽管萌发和附着孢形成阶段的表达模式。结果显示,除了MGG_01876.6,其他14个基因在稻瘟病菌不同生长发育阶段均有表达,说明几丁质酶家族蛋白可能参与稻瘟病菌的生长发育、形态建成和致病过程。     

小菜蛾高致病力玫烟色棒束孢菌株的筛选

小菜蛾(Plutella xylostella)是全球十字花科蔬菜上的重要害虫,并且对常用的化学杀虫剂产生了严重的抗性,每年给农业蔬菜带来了巨大损失。本研究选择分离自不同鳞翅目的 8个玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)菌株,依据菌株生长速度、产孢量、萌发率和产胞外蛋白酶水平等生物学性状进行初步筛选。在此基础上,筛选出生物学性状优良菌株RCEF2180、RCEF3423、RCEF3496对小菜蛾幼虫进行生物测定。最后筛选出了生长速度快、产孢能力强、萌发率高、胞外蛋白酶产酶水平高及杀虫效果好的玫烟色棒束孢RCEF3423菌株。该菌株对小菜蛾的校正死亡率达96.16%,感染率达91.67%,在浓度为1×107孢子/mL时的半致死中时仅为4.58 d,显示出对小菜蛾的极强毒力,因此该菌株在小菜蛾的生物防治中具潜在的应用价值。     

橡胶树抗病相关基因HbNPR1的克隆及其表达分析

前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188,通过Blast比对分析发现,该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对,设计引物进行PCR扩增,得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)1 374 nt,含有两个外显子和一个内含子,编码457个氨基酸,蛋白分子量为51.0 ku,等电点5.82,具有BTB/POZ、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR定量分析发现,HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高,特别是古铜期叶片;多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)诱导下HbNPR1基因在抗病品种(IAN873)的表达丰度明显高于感病品种(PR107);另外,SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达,SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明,HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

以甘蔗(Saccharum spp.hybrid)抗黑穗病基因型崖城05-179为材料,采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列(GenBank登录号为KF279661),命名为ScChiⅦ1,序列长907 bp,编码299个氨基酸,属于糖苷水解酶第19家族,预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示,该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列(GenBank登录号为KF279662)分析显示,该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明,甘蔗黑穗病菌胁迫下,ScChiⅦ1在抗病(崖城05-179)和感病基因型(柳城03-182)中差异表达,推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示,ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达,但在芽中表达量最高,推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。     

玉米ZmPRR1-1基因启动子的克隆及序列分析

克隆玉米伪应答调控基因ZmPRR1-1启动子并对其序列进行分析,以期为深入研究ZmPRR1-1基因的调控机制及基因功能提供参考。以玉米黄早4的叶片为供试材料,参考已公布玉米自交系CML247基因组中ZmPRR1-1启动子的序列信息设计引物,克隆ZmPRR1-1基因的启动子,并利用生物信息学对启动子中的核心区域、顺式作用元件、转录因子结合位点和CpG岛进行预测分析。克隆得到长度约2 600 bp的ZmPRR1-1启动子,预测ZmPRR1-1启动子可能存在2个核心启动子区域,除了存在核心元件TATA-box和启动子增强元件CAAT-box外,还存在光响应、激素应答、胁迫响应等顺式作用元件。转录因子结合位点分析表明,ZmPRR1-1启动子区中预测包含ERF在内的6种转录因子家族,此外在启动子区域中预测存在4个符合限定条件的CpG岛区域。玉米ZmPRR1-1启动子区域存在丰富的顺式作用元件和转录因子结合位点,暗示ZmPRR1-1可能受到外界多种类型调控因子的调控并启动转录起始,且在多种调控网络中发挥功能。     

玉米谷氨酰胺合成酶基因家族的生物信息学分析

谷氨酰胺合成酶(GS,EC6.3.1.2)是氮素代谢途径中的关键酶,对植物的生长和发育至关重要。采用多种生物信息学软件对6个玉米GS基因的可变剪接现象、核苷酸序列、编码蛋白序列、磷酸化位点、基因组结构、同源进化关系以及启动子顺式作用元件进行系统的生物信息学分析。结果表明,5个玉米GS基因存在可变剪接现象,编码蛋白的氨基酸数目为356~423个;6个玉米GS蛋白存在19~38个的磷酸化位点,各成员基因组序列上含有10~15个外显子;玉米GS基因可划分为GS2、GS1-1、GS1-2和GS1-3等4个亚组;6个基因定位到1、4、5、9和10号共5条染色体上,6个成员的启动子区域含有MYB结合位点、水杨酸响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等重要的调控元件。     

大豆GmABCG40基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥At ABCG40在大豆中的同源基因,获得了Gm ABCG40基因序列。通过对Gm ABCG40基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:Gm ABCG40基因CDS序列全长4 284 bp,编码1 427个氨基酸。Gm ABCG40编码的蛋白为疏水性蛋白,具有多个N-糖基化位点、激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、2个ATP/GTP结合位点基序A和1个速激肽家族信号。结构域分析表明Gm ABCG40含有2个核苷酸结合域与2个跨膜结构域,形成NBD1-TMD1-NBD2-TMD2结构,属于ABCG亚家族的成员。Gm ABCG40预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、胚乳表达和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明Gm ABCG40与菜豆、红豆、木豆、百脉根等豆科植物亲缘关系较近。组织特异性表达分析结果显示Gm DABCG40在叶片中表达量最低,在根中表达量最高,推测其可能参与根中ABA的转运过程。     

GmAGL15基因启动子的克隆及序列分析

为探明大豆CanAGL15基因的表达调控规律,应用电子克隆技术从大豆基因组中克隆了CanAGL15 1000 bp的启动子序列,用PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的一般结构,如TATA-BOX、CAAT-BOX.另外还含有一些顺式作用元件,如调控GmAGL15的组织特异的和特定发育阶段的表达,对胁迫的应答,对光的响应,以及反馈调节,推测大豆GmAGL15基因表达有相应组织特异性,可能受蔗糖、生长素和乙烯等的调控.用FootPrinter和PLACE在线工具对大豆与拟南芥等其他4种植物的同源基因启动子的顺式元件进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了CanAGL15基因表达调控的精确性或多样性.     

普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物抗病性密切相关。为深入了解几丁质酶基因表达及功能,先利用引物ChiF/ChiR从10份具有不同抗病性的小麦中克隆出几丁质酶基因后对其进行序列分析及原核表达分析,再利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析小麦根、茎和叶不同组织中几丁质酶基因的表达情况,并选取在小麦根、茎和叶中表达量最高的几丁质酶基因进行真菌性病害的抗性反应试验。结果表明,从10份具有不同抗病性的小麦中克隆得到5条长度约960bp的几丁质酶基因序列,其中1条序列与已公布的Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)一致,其余序列命名为Cht1~Cht4(GenBank登录号为KR049247~KR049250)。序列分析表明,克隆所得序列无内含子,编码的几丁质酶属于ClassⅠb类型,也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明,重组质粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表达一个33kDa左右的特异蛋白。qRT-PCR分析表明,这5种几丁质酶基因在小麦根、茎和叶中均有表达,但在不同器官中表达量差异较大,其中,叶中表达量最高,根中次之,茎中最低;同时,这5种几丁质酶基因在同一器官中表达量大小具体表现为Cht4Cht2Cht3Cht1Chi-3。选取相对表达量最高的Cht4基因验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,在条锈菌胁迫下,Cht4基因在抗病材料92R137中的表达量显著高于感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH2O的表达量。本研究扩增到的几丁质酶基因在小麦中组成型表达,说明其参与了小麦的正常生长发育过程;Cht4基因的表达受条锈菌诱导,推测其可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。     

拟南芥热激启动子（HSP18.2）在水稻中的启动效率探讨

从拟南芥中克隆热激蛋白基因HSP18.2的启动子区域,构建了由HSP18.2启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入籼稻愈伤组织中。对热激和常温条件下转基因籼稻愈伤组织中GUS活性的比较测定表明,HSP18.2启动子在热激条件下可驱动GUS报告基因在转基因愈伤组织中高效表达,而常温条件下GUS活性在检测水平以下,证明HSP18.2启动子在籼稻中对基因的调控十分灵敏。     

蓖麻基因组中一种Mutator-lik类型MITEs元件的结构分析和鉴定

利用生物信息学方法，对蓖麻基因组Mutator-like类型MITEs元件进行了分析和鉴定。结果表明，蓖麻基因组上共鉴定出76个小于3 kb的Mutator-like类型MITEs元件，其中长度小于1 000 bp的元件有53个，占69.7％。这些MITEs元件中有42个位于基因间隔区，11个位于基因内含子区，位于5'UTR和3'UTR区的分别有8个和4个，另有1个位于基因编码区。29个MITEs元件带有转座酶以外的功能基因片段，成为pack-MITEs。多个pack-MITEs带有相同的非转座酶基因片段。Mutator-like类型的MITEs对蓖麻基因的表达和基因组的进化有潜在的影响，值得深入分析。     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

水稻二化螟诱导表达基因OsSABATH启动子的克隆与缺失体构建

Northern杂交结果表明,OsSABATH基因受二化螟(Chilo suppressalis)为害诱导表达,但却不受机械损伤诱导。利用该基因序列和水稻基因组数据库相应序列设计引物,扩增到该基因编码区5′上游2050 bp的启动子序列。用PLACE软件分析顺式作用元件,发现该基因起始密码子上游1.4 kb的区域内存在几个可能与该基因表达调控相关的顺式作用元件,如W盒、DOF 结合序列、GT 1、 BIHD1 结合序列等。将该基因启动子区域及其5′部分缺失构件与GUS报告基因相连,并克隆进pCAMBIA1391载体中,用于分析启动子活性及虫伤诱导特异性相关的顺式作用元件。     

Isolation and characterisation of a xylanase inhibitor Xip-II gene from durum wheat

Cereals contain xylanase inhibitor proteins (XIPs) which inhibit microbial xylanases from glycoside hydrolase families 10 and 11. Here, we report for the first time the isolation and characterisation of a genomic clone containing a xylanase inhibitor gene. This gene, Xip-II, isolated from a durum wheat genomic library (Triticum durum Desf.) encodes a mature protein of 307 amino acid (aa) residues that shares highest aa sequence identity (64%) with the rice RIXI xylanase inhibitor. XIP-II showed inhibition against family 11 xylanases and no chitinase activity. In silico analysis of the 5′ promoter region of Xip-II revealed sequences with similarity to known cis regulatory elements upstream from the initiation codon. In particular, the identification of a number of cis-acting elements controlling the expression of defence and seed-specific genes supports the role for this class of inhibitors in plant defence against pathogens but also provides new clues on a potential role in plant development.     

The effect of heat stress and cadmium ions on the expression of a small hsp gene in barley and maize

Small heat shock proteins in plants are produced under stress conditions and play an important role in stress tolerance. The gene Hvhsp17 isolated from barley encodes a class I, low molecular weight heat shock protein (or sHSP) which is induced in barley seedlings in response to heat stress. Previous molecular analysis of the 5′ promoter region of Hvhsp17 uncovered several cis regulatory elements upstream from the ATG of the gene, two heat shock elements (HSE1 and HSE2), and a sequence highly homologous to a metal responsive element of mammalian cells. The importance of the protective role of these elements against abiotic stresses was investigated both in barley and in maize. The expression profile of Hvhsp17 in response to various environmental conditions was analysed in these two cereals, to understand the regulation of Hvhsp17 gene expression and also in relation to conditions other than heat shock. The expression of Hvhsp17 in both barley and maize is strictly associated with heat stress, except for treatment with cadmium ions.     

甘蔗ShSUT4基因及其5＇侧翼序列的克隆与序列分析

以甘蔗品种FN28为材料,首次克隆甘蔗ShSUT4基因。测序结果表明,该基因约为4.8 kb,包含5个外显子和4个内含子,并包括完整的开放阅读框。该基因5＇侧翼序列长度约为1.8 kb。采用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明,该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box等,还含有一些顺式作用元件如光响应元件、MYB结合位点、ABRE响应元件等,表明甘蔗ShSUT4基因的表达可能受光照、MYB和ABRE等的调控。