草莓psy、pds和zds基因克隆及植物表达载体的构建

设计特异引物,分别克隆草莓类胡萝卜素合成关键基因psy、pds和zds开放阅读框,将psy和pds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建了植物表达载体pBI121psy和pBI121pds.将psy和zds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建植物表达载体pCAMBIA1301psy和pCAMBIA1301zds.将带有完整启动子和终止子的pds基因引入pCAMBIA1301psy中,最终获得psy和pds的双价植物表达载体pCAMBIA1301psy-pds.经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI121psy、pBI121pds、pCAMBIA1301psy、pCAMBIA1301zds和pCAMBIA1301psy-pds 5个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中.该研究结果为进一步研究草莓psy、pds和zds基因的功能奠定基础.     

大豆7S蛋白β亚基基因RNAi表达载体构建

以大豆7S蛋白β亚基基因为靶基因(基因编号:AB030840),利用RT-PCR克隆得到大豆7S蛋白β亚基基因核心序列398 bp,构建了以抗除草剂基因BAR为筛选标记的安全植物RNAi表达载体BAR-7αp-β.分子生物学检测表明7S蛋白β亚基基因的表达载体构建成功.研究结果为应用RNA干扰技术降低大豆过敏原,提高大豆蛋白品质奠定了基础.     

应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体

RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

块根特异启动的木薯SBE I、SBE Ⅱ基因 RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物,以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因,全长959 bp,编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因,利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体,为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。     

CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA(c)和gna基因相融合,得到CryIA(c)-2A-gna抗虫融合基因。并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA(c)-2A-gna)分别连接到植物表达载体pCAMBIA3300上,构建成由玉米UBI启动子驱动抗虫融合基因的植物表达载体pNUBG。经过限制性酶切分析鉴定,结果表明,含有融合基因的植物表达载体构建成功。     

红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定

以pET-28a-RFP质粒为模板,PCR扩增红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因,并克隆到真核表达载体pTE11上,置于RP27启动子调控之下,成功构建表达载体pTE11-RFP。采用PEG介导转化法,将pTE11-RFP转入银耳芽孢中。提取转化子基因组DNA,RFP基因特异性引物扩增获得与目的基因大小一致的特异条带;日光下肉眼观察转化子略显红色,荧光显微镜观察有明显的红色荧光。以上结果证明RFP基因已成功转入银耳芽孢并进行表达,RP27启动子可以调控外源基因RFP在银耳芽孢中的正确表达,为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定了一定的基础。     

番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

利用GATEWAYTM技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体

通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRsV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性.为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATEI体和GATEWYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体.具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增日C-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-prd基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSV HC-pro基因的RNAi表达载体.     

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

玉米类受体激酶基因Psy2的生物信息学分析及RNAi转基因表达鉴定

根据玉米细菌性褐斑病抗病基因的定位结果预测得到1个编码受体激酶(Receptor-like kinases,RLKs)基因Psy2,采用生物信息学方法对显性基因Psy2和隐性基因psy2编码蛋白的结构、功能和理化性质进行预测和分析。结果表明,psy2的编码氨基酸与Psy2相比共有57个氨基酸差异,包括起始密码子Met提前1位、1个精氨酸的缺失和55个氨基酸替换;两者理化性质差异较小,都被归类为不稳定蛋白;都具有信号肽,属分泌性蛋白;psy2无法形成有效跨膜结构域(Transmembrane domain,TM),但都定位于质膜;Psy2基因的进化与相应的物种进化相一致。推测psy2蛋白的氨基酸残基替换、缺失以及跨膜结构域的改变影响了信号的正常传导。通过基因枪转化法将RNA干扰表达载体导入受体HiⅡA×HiⅡB的幼胚,获得阳性转基因植株,经过q RT-PCR检测显示,Psy2a-RNAi在成株期(开花期)的干扰效果比苗期显著增强。     

植物防御素D1基因种子特异表达载体构建及在玉米中的转化

以绿豆基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增了绿豆防御素D1基因序列,与GenBank中绿豆防御素基因的相应片段有99.08%同源性,克隆片段长为355bp。将种子特异启动子sbeIIb和D1基因插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH中,构建了无抗生素选择标记的种子特异表达载体pSBEIIb-D-B,该载体是利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记,消除了对环境及肠道微生物的潜在威胁。将该载体利用超声波辅助农杆菌介导法转化了2个玉米自交系丹598、988的愈伤组织,经分化诱导出苗后进行PCR检测,证明得到转基因阳性植株,相对转化率最高达到7.8%。     

水稻隐花色素基因Cry1a/Cry2/Cry1bRNAi表达载体构建及遗传转化研究

构建一个包含3个水稻隐花色素基因片段的RNAi表达载体pSC 1301-347-Cry1aCry2Cry1b并转化水稻,以期导致Cry1a、Cry1b与Cry2集体沉默,观察它们对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期显著延迟,结实率骤降,株高增加,剑叶变短,谷粒变长、变宽;而剑叶宽、穗长与对照无显著差异.     

利用RNAi方法构建MS26基因雄性不育植物表达载体及农杆菌介导玉米遗传转化研究

应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。     

青稞Hva1基因的表达模式及表达载体的构建

为了解青稞种子胚胎成熟晚期丰富蛋白(LEA)基因Hva1与青稞抗旱性的关系,以抗旱性强的旱地紫青稞和抗旱性弱的大麻青稞为材料,研究了不同浓度PEG胁迫下Hva1基因在两个青稞品种中的表达模式。结果表明,Hva1基因在抗旱性不同的两个青稞品种中的表达均呈单峰模式,且抗旱性强的旱地紫青稞表达峰值和对应的PEG胁迫浓度均高于抗旱性弱的大麻青稞;PEG胁迫浓度大于13.18%时,旱地紫青稞的Hva1基因表达量高于大麻青稞。可见,Hva1基因的表达在青稞的抗旱中起到重要的作用,为此我们成功构建了青稞Hva1基因的过量表达载体,期望为抗逆性基因在青稞中的应用和抗旱新品种的选育奠定基础。     

木薯淀粉分支酶基因双价块根特异性反义表达载体的构建

淀粉分支酶(starch branthing enzyme,SBE)是高等植物淀粉生物合成的关键酶之一,包括分支酶I(SBEI)和分支酶II(SBEII)两种类型,调控着支链淀粉的合成.利用DNA重组技术,将这两种分支酶反义基因片段构建在一个植物表达载体中,形成双价反义表达载体p1301-SBEII-Spo-SBEI,其中SBEI反义基因置于CaMV35S启动子之后,SBEI反义基因置于块根特异型启动子.Sporamin之后,两者具有各自的Nos终止子.通过反复冻融法,将双价表达载体转入农杆菌EHA105,并采用PCR技术对所构建的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析.     

象耳豆根结线虫Me-mapk1基因的克隆及RNAi分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是线虫体内信号转导的重要组分,在生长发育过程中具有重要作用。本研究从象耳豆根结线虫中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1c DNA序列,该序列全长1 369 bp,包含1个1 185 bp的完整开放阅读框,推导编码394个氨基酸,蛋白质分子量为45.39 ku。同源性搜索比对结果发现,该基因编码的蛋白序列与南方根结线虫MI-MAPK1具有99%的一致性。通过构建原核表达载体p ET-32a-MAPK,在IPTG的诱导下得到70 ku左右的特异融合蛋白(包括大小约26 ku的标签序列)。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄幼虫Me-mapk1基因进行沉默,线虫诱导番茄根结形成的数量显著减少,推测Me-mapk1基因的下调表达有可能影响象耳豆根结线虫二龄幼虫(J2)的生长发育。