橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是为害我国主要热带作物的植物病原真菌,其寄主范围广、形态差异显著、症状类型多样,且含有一种寄主专化性毒素Cassiicolin,存在6种毒素类型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1~Cas6型）,构建了含287个菌株的国内橡胶树和部分热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,建立了一套特异性强、灵敏度高的分子检测技术,可检测100 pg/μL的目标基因组DNA,系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物的919株多主棒孢的毒素类型,发现国内仅存在Cas2和Cas5这2种毒素类型,其中Cas5型的菌株占94.8%,为橡胶树多主棒孢的优势种群和特有毒素类型。而Cas2型是橡胶树和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系统发育分析发现,不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关,但与地理来源没有明显的相关性,且Cas5型多主棒孢具有明显的寄主专化性。通过构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库,为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群结构和优势种群情况,发掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要的指导意义。     

不同寄主多主棒孢对橡胶树叶片组织防御酶活性的影响

以分离自4种寄主的5株多主棒孢菌株接种橡胶树叶片，均得到成功侵染。并按时间顺序测定了来自不同寄主的多主棒孢侵染橡胶树叶片后，细胞防御系统相关的4种酶活性的变化。结果表明，接种来自不同寄主的多主棒孢后，对橡胶树叶片4种防御酶活性的影响不同。其中分离自橡胶树的HCCGD01和HCCHN42两个菌株侵染后，橡胶树叶片组织4种防御酶活性变化最大，均有明显增强；来自木薯的MaCCGD02侵染橡胶树叶片后，酶活性变化次之；分离自番木瓜的CpCCYN01和黄瓜的PaCCSD04多主棒孢菌株侵染后，除PAL外，β-1,3-葡聚糖酶、POD、PPO活性变化很小。     

国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素多样性及致病性分析

由多主棒孢引起的棒孢霉落叶病是橡胶树的主要叶部病害,cassiicolin毒素是病菌的主要致病因子。本研究通过ITS序列分析对供试多主棒孢菌株进行了准确鉴定,利用cassiicolin毒素不同亚型编码基因特异引物对不同地理来源和寄主来源的49个多主棒孢菌株毒素类型进行了分析,并利用生物萎蔫法对不同亚型毒素进行了致病性分析。结果显示,78%供试菌株含有cassiicolin基因,其中Cas2亚型有10个菌株,Cas5亚型有28个菌株,其它为Cas0型(未检测到cassiicolin毒素基因)。含有Cas5亚型的菌株均来源于橡胶树,并且为橡胶树上的优势群体;Cas2亚型菌株则来源于橡胶树、黄瓜、番木瓜和木薯等不同作物;Cas2和Cas5毒素对不同橡胶树品种的致病性存在明显差异。     

吉林省玉米灰斑病菌的致病性分化研究

选用9个自交系材料作为玉米灰斑病致病性分化的鉴别寄主,对采自吉林省不同地区的14个菌株进行致病性分化研究。结果表明,不同菌株侵染寄主病斑表现不同的反应型,不同菌株间致病力存在差异。根据在鉴别寄主上的发病等级可将吉林省玉米灰斑病菌菌株分为5个致病类群,其中,Ⅰ为强致病类型,包括1号和8号菌株;Ⅱ、Ⅲ为中等致病类群,包括7、9、10、12、13、14号6个菌株;Ⅳ、Ⅴ为弱致病类群,包括2、3、4、5、6、11号菌株。玉米灰斑病菌存在明显的致病分化现象。     

橡胶树多主棒孢病菌遗传多态性分析

利用ISSR（简单序列重复区间扩增多态性）和RAPD（随机扩增多态DNA）技术对供试的18个多主棒孢菌株进行了遗传多态性分析,研究结果表明,2种分子标记技术均能揭示橡胶多主棒孢病菌的遗传多态性。同时利用P距离模型构建了18个多主棒孢菌株的UPGMA聚类分析树状图,根据2种技术构建的UPG—MA聚类树状图可将供试菌株分为3个主要类群。ISSR类群和RAPD类群与地理来源均不存在明显的关系。     

不同来源橡胶树多主棒孢病菌致病性及基础生物学特性的比较

对已在我国海南、云南、广西等省区橡胶树上发生为害的3株多主棒孢病菌(Corynespora cmssiicola)和来自印度的橡胶树多主棒孢病菌进行了致病性及基础生物学特性的比较研究.结果表明,印度HCcYD01菌株的致病力最强;基础生物学特性测定结果表明,参试的3株国内菌株与印度菌株问除分生孢子大小、孢子萌发和致死温度相似外,在菌落形态、最适培养基、光照条件、碳氮源利用、最适生长温度和pH等方面存在一定差异.由多主棒孢引起的橡胶树棒孢霉落叶病业已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素,本研究旨在了解我国橡胶树棒孢霉落叶病的最初发病病原,为该病发生规律的研究及防控措施的制定提供理论依据.     

串珠镰孢对棉苗致病力分化及其在单分生孢子后代的遗传

采用菌丝块创伤接种法,分别测定了不同寄主来源的串珠镰孢对棉苗叶片的致病力。结果表明,所有供试菌株接种棉苗后均可引起发病,但不同菌株所致病斑的平均直径有显著差异,提示串珠镰孢菌株间对棉苗叶片的致病力存在明显的分化,来自棉花的菌株对棉苗叶片的致病力较强,来自玉米和水稻的菌株对棉苗叶片的致病力较弱;即使来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异,但菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关。以菌株Fm1、Fm19和Fm31为亲本,采用同样的接种法测定了串珠镰孢对棉苗致病力在单分生孢子后代的遗传变异。结果表明,串珠镰孢对棉苗的致病力在单分生孢子后代能连续两代稳定遗传。     

巴西橡胶树主要种质对棒孢霉落叶病抗性评价

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的橡胶树棒孢霉落叶病已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素。本实验对从我国海南、云南和广西等地分离得到的17个橡胶树多主棒孢病菌菌株进行了致病性测定,获得强致病力菌株HC-10。分别用该菌株菌丝体接种鉴定、粗毒素叶片穿刺接种和叶片萎蔫生物鉴定等3种方法对我国选育的45个巴西橡胶树品种进行抗病性评价。结果表明,不同橡胶树品种对棒孢霉落叶病的抗性水平存在明显差异。在供试的45个品种中,不同抗性评价方法的鉴定结果基本一致,抗病品种占13.3%~17.8%;轻感病品种占66.7%~73.4%;易感病品种占11.1%~17.8%。     

尖孢镰刀菌致病性菌株遗传多样性的ISSR分析

致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种世界性分布的作物土传病原真菌,为明确其不同寄主及专化型菌株遗传差异性和亲缘关系,利用ISSR分子标记技术对来源于不同寄主（专化型）及地理分布的43个菌株进行了遗传多样性分析。结果表明,供试的15条引物通过ISSR-PCR 扩增,共扩增出147条条带,其中多态性条带为144条,平均多态性条带达98.0％。43个菌株的聚类结果表明,各菌株间的遗传相似系数为0.67～0.97,且遗传多样性与其寄主和地理来源没有明显的相关性。进一步将供试菌株中葫芦科与茄科作物尖孢镰刀菌分别进行聚类分析,当遗传相似系数为0.84时,16个葫芦科的菌株可分为6个ISSR类群;当遗传相似系数为0.77时,16个茄科的菌株亦可分为6个ISSR类群;且均表现为相同寄主或专化型菌株因地理来源不同,被归属于不同的ISSR类群,说明寄主或专化型相同的菌株与地理来源存在一定的相关性。     

橡胶树多主棒孢病菌原生质体转化体系的建立

由多主棒孢病菌侵染引起的棒孢霉落叶病是严重危害橡胶生产的一种世界性病害,近年来在中国也有发ⅱ生.在菌龄、细胞壁酶种类、酶作用浓度、作用时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素对橡胶树多主棒孢原生质体制备和再生影响分析的基础上,笔者首次建立了PEG介导的多主棒孢病菌遗传转化体系,并获得了多主棒孢病菌绿色荧光转化子.该体系中,多主棒孢病菌的原生质体再生率为19.12%,转化率为10.34个/μgDNA.     

国内橡胶树尖孢炭疽复合种种间分子系统发育及生物学特性分析

为明确国内橡胶树尖孢炭疽复合种内不同种的生物学特性及种间差异情况,评价了4个代表性菌株（Colletotrichum bannanense YNML52,C. laticiphilum YNJH17109,C. australisinense GX1655,YNJP162）对不同碳源、氮源的利用情况,以及在不同温度、pH、水活度下的生长情况,并评价了这些菌株对橡胶不同品种和不同作物的致病性。结果表明：供试菌株在碳源、氮源利用,适宜生长温度、致死温度、pH和水分活度等方面均存在显著差异;致病性分析表明,供试菌株的致病谱也存在显著差异,YNML52的寄主范围较窄,具有很强的寄主专化性。通过评价生态因子对橡胶树炭疽病病原菌生物学特性的影响,为深入了解橡胶病害发生规律和制定有效防控措施提供指导依据。     

橡胶树多主棒孢拮抗细菌BACYitc8-7的分离鉴定及其挥发性抑菌物质组分分析

多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）是为害橡胶叶片的一种重要病原真菌,目前生产上普遍使用化学农药防治该病害,给植胶区的生态环境带来很多负面影响,从橡胶树根际土壤中筛选对橡胶树多主棒孢菌具有高拮抗活性的细菌,可为橡胶树棒孢霉落叶病生防药剂的研发提供理论依据。本研究通过稀释涂布、平板对峙法从发病橡胶树根际土壤中分离筛选到1株对橡胶树多主棒孢菌具有高拮抗活性的细菌,抑菌带为(57.68±0.66)mm,且该菌株对9种重要的植物病原真菌均具有抑制作用;经过形态观察、生理生化检测及16S rRNA基因序列分析,结果发现其与铜绿假单孢菌基本相符,命名为BACYitc8-7;以LB、NA、高氏、金氏B和PDA为营养来源,评定不同营养条件下菌株BACYitc8-7挥发性物质对多主棒孢菌的抑制作用,发现菌株BACYitc8-7在金氏B和LB培养基上的拮抗作用最强,抑菌率达43.47%~48.69%;利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）收集并检测菌株BACYitc8-7挥发性物质的抑菌组分,获得包括胺类、醇类、烯类、酚类、酯类、吡嗪类等35种物质,其中含量前5的物质为胺、硼烷二甲硫醚络合物、异戊醇、1-十三烯和2-甲基-3-甲硫基呋喃。     

木薯根系分泌物与土壤浸出液对橡胶树2种致病菌的化感效果

采用平板试验,通过生长速率法分析木薯根系分泌物及其土壤浸出液对橡胶树白根病病菌及棒孢霉落叶病病菌的化感效果,为判断胶园林下种植木薯的可行性提供理论依据。结果表明：（1）木薯根系分泌物对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均表现为化感促进效果,但在任一处理时间,不同浓度间对白根病病菌的化感效果与对照均未达显著差异,而对棒孢霉落叶病病菌的化感效果呈现明显的剂量效应,浓度达40 mg/mL时,化感促进效果与对照达到显著水平。（2）木薯根系分泌物的任一浓度,对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌的化感效果,在不同处理天数间均未达到显著水平。（3）木薯土壤浸出液对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均呈现化感促进效果,且存在明显的剂量效应;对橡胶树白根病病菌,处理后2 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为40 mg/mL,处理后3 d和处理后4 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为8 mg/mL;对棒孢霉落叶病病菌,在任一处理时间达到显著化感效果的浸出液浓度均至少为200 mg/mL。（4）土壤浸出液小于8 mg/mL时,3个处理时间之间的橡胶树白根病病菌化感效果无显著差异,当浓度达到40 mg/mL时,处理后2 d的化感促进效果显著大于处理后3 d和4 d;4种土壤浸出液的任一浓度,对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感效果在不同处理时间之间均未达到显著差异。所以说,幼龄胶园间作木薯会在一定程度上促进橡胶树棒孢霉落叶病和白根病的发生。     

海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

白蚁（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（Streptomyces）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、香蕉炭疽霉（Colletotrichum musae）、辣椒棒孢霉（Corynespora cassiicola）、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉（Phomopsis asparagi）、荔枝疫霉（Peronophythora litchi）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。     

越南油茶40年生实生林优株筛选与遗传多样性分析

为了筛选越南油茶实生老林优株和探讨实生变异的遗传多样性,在海南省保梅岭生态保护区以40年生油茶老林32个丰产单株为试验材料,开展了主要农艺性状、经济性状和品质性状的田间调查和实验室检测。结果表明：从32个丰产单株中筛选出果实丰产性良好或果实、种子含油率较高的优株共20株,其中金波5号和23号果实丰产、果实和种子含油率较高;32个单株茶籽油理化性质和脂肪酸含量基本上都达到了《油茶籽油》（GB/T11765-2018）的要求;依据农艺和经济性状、茶籽油理化性质和茶籽油脂肪酸组成等差异分别作聚类分析,可以分别归属成6类（r ²=0.932）、10类（r ²=0.864）和7类（r ²=0.937）,3项聚类分析结果都能区分出丰度较高和较低的基因型种类,20个优株分别归属到全部6类、10类中的7类和全部6类中,说明越南油茶实生变异存在丰富的遗传多样性、不同种类基因型存在丰度差异,不同优株分属不同基因型种类。可见,越南油茶的育种目标应以丰产性和稳产性为主,金波5号和23号是有希望上升为品种的优株;越南油茶具备丰富的遗传多样性,且不乏有特色的稀有种质。     

暹罗炭疽菌中脂滴包被蛋白Cap20与乙酸激酶CsAck的互作研究

暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,是我国橡胶树炭疽病（Colletotrichum leaf disease, CLD）的田间优势病原种,也是热带、亚热带地区许多其他农林作物炭疽病的主要病原种。脂滴是细胞的中性脂,存在于绝大多数真核细胞中,是细胞内甘油三酯的主要贮存形式。脂滴在细胞内可以参与脂质代谢、膜转运、蛋白降解和信号传导等。包被蛋白（perilipin）是脂滴表面最丰富的脂质相关蛋白,主要存在于动植物体内,对细胞内脂滴代谢起着重要的调控作用。Cap20是暹罗炭疽菌中包被蛋白的同源蛋白,前期证实Cap20是一个致病相关蛋白,它参与了炭疽菌附着胞膨压形成、脂滴数量和致病性。了解其互作蛋白和互作的生物学意义可能为深入了解脂滴包被蛋白参与的致病分子机制具有重要意义。课题组前期通过酵母双杂交技术在暹罗炭疽菌cDNA文库中筛选到一个与Cap20互作的候选蛋白乙酸激酶,本研究克隆了该乙酸激酶的编码基因,并进行了蛋白结构和同源蛋白聚类分析。结果表明,乙酸激酶编码基因的DNA大小为1312 bp,包括一个内含子,cDNA为1248 bp,编码415个氨基酸,含有一个乙酸激酶结构域,命名为CsAck。然后构建含6×his标签的原核表达载体PET32a-CsAck,利用其和含GST标签的pGEX6p-1-Cap20（先前构建）进行蛋白表达和纯化,获得含有6×His标签的融合蛋白CsAck和含有GST标签的Cap20。通过Pull down验证了Cap20和CsAck蛋白之间的体外互作。最后,构建含有潮霉素转移酶基因HPH的表达载体PXY203-CsAck-S和含有氯嘧磺隆抗性基因ILV1的表达载体pCB1532-GFP-Cap20,将它们共同转化暹罗炭疽菌野生型菌株获得转化子。Co-IP（Co-immunoprecipitation）的结果证实Cap20和CsAck在暹罗炭疽菌中可以相互作用。该结果证实了致病性相关蛋白Cap20和乙酸激酶CsAck在体外和体内均可发生蛋白互作,可为进一步研究Cap20在暹罗炭疽菌中的致病功能和调控机制奠定基础。     

橡胶树胶孢炭疽菌组蛋白乙酰转移酶CgGCN5调控致病力功能研究

胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究该病原菌致病力的分子机制能够为新型防控策略的研发提供理论依据。在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在1个编码组蛋白乙酰转移酶的基因CgGCN5。在本研究中,通过同源重组原理及原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5的敲除突变株和互补菌株,并对其生长、产孢及致病力等表型进行了初步分析。结果表明,与野生型菌株相比,CgGCN5敲除突变株的生长速率、产孢能力均显著下降;并且突变株对橡胶树叶片的致病力也显著下降;进一步分析表明,突变株丧失了对玻璃纸的穿透力。与此同时,互补菌株能够恢复突变株的相应表型。以上结果表明,CgGCN5在调控胶孢炭疽菌的生长及致病力中起重要作用。     

柱花草胶孢炭疽菌致病力鉴定和致病类型分析

用2套鉴别寄主分别对47份A型菌和57份B型菌的致病力进行鉴定,研究表明,不同的柱花草炭疽病菌株致病力不同。应用最大似然法(EML法)对鉴别寄主的致病力鉴定结果进行聚类分析,A型菌可划分成3大小种类型,且其聚类非常紧凑,表现出一定的寄生专化性;而B型菌可划分成2大小种类型,但其在型内分化较为复杂,说明B型菌将来有可能分化出更多的小种类型。从地区而言,无论A型菌还是B型菌均表现为海南菌株的致病力最强,其中尤以昌江和东方的菌株致病力最强。因而对病原变异和进化动态的监测十分必要。     

东北地区玉米弯孢菌的致病性分化与RAPD分析

在东北三省15个地区采集分离26个玉米弯孢菌菌株,通过鉴别寄主技术与RAPD分子标记技术进行致病性与遗传分化的研究。结果表明,东北地区玉米弯孢菌在致病性与遗传上都存在明显的变异,二者有一定的相关性,未发现变异程度与菌株地理来源有明显的直接关系。26个菌株的致病性分为5种类型,其中中等致病类型分布遍及东北三省,为优势致病类群;强致病类型分布在吉林省的白城市;弱致病类型主要分布在吉林省的白山和梨树。用8个引物对供试菌株进行RAPD扩增,共获得77个RAPD标记,其中多态性标记71个,多态性比例92.2%。供试菌株在相似系数约0.71处共聚为4组,大多数致病性较强的菌株聚在一起,而弱致病株在相似系数相对较低时和其他菌株聚在一起。