非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板，运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因，运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明，获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内，与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性，达99．0％。牛与绵羊Prnp基因同源性为97．3％，推导氨基酸序列同源性为96．5％。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86．7％和87．1％，其氨基酸序列的同源性均为90．0％。3种Prnp基因均有富含G—C的重复区，编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合位点组成。基因型分析表明，秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gI） 基因核苷酸序列测定及分析

对我国最早分离的伪犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)Fa株糖蛋白gp63(gI)基因核苷酸序列及的氨基酸序列作了测定与分析，完整的gp63(gI)结构基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有1050个核苷酸残基，编码由439个氨基酸残基构成的多肽链，4种核苷酸残基的构成比分别为：G35．9％，11.33%,T11.81%,C40.95%,G C含量达76．85％，PRV Fa株gp63基因核苷酸序列与Nice株的相比，两者同源性达98．13％，仅存在3个核苷酸残基的缺失变异，氨基酸推导序列分析表明，糖蛋白gp63具有典型膜蛋白特征，与Nice株相比，同源性为97．42％，gp63基因起始密码子由3个连续的ATG组成，ATG上游区域内无启动子调控区序列。     

2种家养动物朊蛋白基因的扩增与分析

采用PCR方法扩增了云南矮马和北京油鸡的PrP^C基因，并进行序列测定，结合已发表种属朊病毒基因序列，运用分子生物学软件进行同源性分析。结果表明，云南矮马PrP^C基因与已报道的马PrP^C基因比较，其同源性达99％，氨基酸同源性达100％。与牛PrP^C基因比较，同源性达89％，氨基酸同源性达91％。北京油鸡PrP^C基因与鸡的已知序列比较，同源性达99％；与鸭、鸽、鹌鹑的已知序列比较，同源性94％～97％。其翻译的氨基酸序列与鸡的已知序列比较，同源性达99％，与鸭、鸽、鹌鹑比较，氨基酸同源性88％～99％。从本试验结果来看，云南矮马PrP^C基因与牛的PrP^C基因同源性较远，因此感染牛源朊病毒的风险较小，禽类与哺乳动物PrP^C氨基酸属于2个不同的进化分支，因此哺乳动物海绵状脑病不易传染给禽类或引起朊蛋白构型上的改变。这些结果可为海绵状脑病种间屏障补充详细的数据，也为制定相关预防控制措施提供了一些理论依据。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒（PEDV）青海株（PEDV-QH）的M基因。经序列分析，PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框（ORF）全长为681bp，包含154A（22．61％），160G23．49％），217T（31．86％），150C（22．03％），编码226aa，分子质量约为25ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1／87、JS2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98．5％、98．4％、98．4％、98．2％和97．9％，推导的氨基酸序列同源性分别为99．1％、99．19／6、98．7％、98．2％、97．8％；M基因推导的氨基酸序列分析显示，M蛋白3次跨膜，有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点，3个潜在的N糖基化位点，4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1／87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示，PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株（NM）总DNA，参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段，将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列，并用DNAStar软件进行序列分析，分析结果表明，与内源性南非代表毒株enJS56A1（AF153615）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为98．9％，推导出的氨基酸同源性为98．4％。与外源性美国代表株JSRV21（AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．6％，氨基酸同源性为94．8％。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测，结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子，这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。     

5个绵羊品种BMP6基因部分片段的多态及序列分析

根据GenBank发表的绵羊骨形态发生蛋白6（Bone morphogenetic protein6,BMP6）基因部分序列所包含的外显子5、6、7和小鼠BMP6基因外显子5、6、7序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMP6基因外显子5、6和7在小尾寒羊、湖羊、多赛特、特克塞尔、考力代5个绵羊品种301个个体中的单核苷酸多态性。结果发现这3对引物的扩增片段在检测的5个品种中均无多态性,说明所检测的BMP6外显子5、6、7序列比较保守。同时克隆了小尾寒羊（695bp）和济宁青山羊（699bp）部分BMP6mRNA以及小尾寒羊BMP6基因外显子3—4的内含子序列和两端部分外显子序列（785bp）。发现小尾寒羊和济宁青山羊的核苷酸和氨基酸序列差异很小,两者的核苷酸序列同源性高达99．28％,氨基酸序列同源性为98．1％,除济宁青山羊中插入一个丙氨酸外,两者只有4个氨基酸的差异。绵羊与牛、人、小鼠和大鼠的核苷酸同源性分别为97．04％、81．82％、84．68％和85．06％;氨基酸序列同源性分别为99．05％、91．43％、90．48％和92．38％,均大于90％,表明各物种BMP6核苷酸序列虽然差异较大,但氨基酸序列却非常保守。     

禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR方法扩增出禽巴氏杆菌5：A C48-1株的ompH全长片段，将ompH进行T—A克隆、序列测定和分析。结果表明，ompH全长1597bp，含有一个1056bp的开放性阅读框架（ORF），编码352个氨基酸，前20个氨基酸组成信号肽。与已知的15个血清型及痘苗株CU的ompH的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较，核苷酸同源性在51．5％～98．7％之间，氨基酸同源性在39．3％～98，7％之间。氨基酸多序列比较显示，血清型特异性抗原表位位于60～80位和200～220位氨基酸处。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA，根据已报道的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR)及测序技术，对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNAstar软件比较分析了5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株（C－ST株）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现，5株野毒与C－ST株核苷酸序列的同源性为81．7％－83．1％，氨基酸同源性为87．3％－88．6％，表明它们之间存在较大的差异；但5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达98．8％－99．3％，氨基酸同源性为96．6％－99．2％，表明它们之间的差异较小。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达

根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

水貂酪氨酸酶基因外显子1的鉴定及序列变异分析

根据GenBank中公布的雪貂(登录号:EF405957)、大熊猫(登录号:XM_002930310)、家犬(登录号:CFU42219)及猫(登录号:AY959314)的酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)基因DNA序列保守区域,设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定了短毛黑水貂、红眼白水貂和米黄色水貂的TYR基因外显子1部分序列,并对该序列进行了BLAST鉴定及变异位点分析,基于该基因编码氨基酸序列构建了16个物种的系统进化树。结果表明,测定的3种毛色水貂TYR基因序列长度均为796 bp,包括795 bp的外显子1和1 bp 5'UTR,共检测到5个单一突变位点:g.A34G、g.T138A、g.T248C、g.A545G和g.C765A,包含4个错义突变:g.A34G(p.Ser12Gly)、g.T248C(p.Val83Ala)、g.A545G(p.Tyr182Cys)和g.C765A(p.His255Gln),1个移码突变分别出现在短毛黑水貂和红眼白水貂个体间:g.T138A(p.Cys46*),获得TYR基因GenBank登录号分别为:短毛黑水貂(KJ198847)、红眼白水貂(KJ658343)和米黄色水貂(KJ152769)。水貂与雪貂、大熊猫、家犬、猫、家兔、猪、羊驼、山羊、绵羊、牛、人、猕猴、黑猩猩、原鸡和日本鹌鹑的TYR基因核苷酸序列同源性为72.8%～98.6%,相应氨基酸序列同源性为75.0%～98.1%。TYR基因分子进化树显示水貂与雪貂遗传关系最近,分化时间约为1000万年前,且与原鸡和日本鹌鹑亲缘关系最远。该结果为进一步开展TYR基因多态性与水貂毛色表型的相关性研究奠定了生物信息学基础。     

奶牛朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道正常牛朊蛋白(PrP^c)基因(PRNP)序列设计引物，采用PCR法扩增了6头荷斯坦奶牛的PRNP基因，将其克隆到T-Vector。序列测定及分析表明所克隆的奶牛PRNP基因片段为795bp，该基因内无内含子，包含了牛PRNP完整编码区序列，编码264个氨基酸的前体蛋白，推测其分子量约34ku。其中2头共同含有未曾报道的牛PRNP多态性位点M120I，无义突变G234A，但未引起酶切位点变异，未发现插入或缺失变异；与已报道牛PRNP序列(GenBank收录号为DI0613)相比，两者核苷酸序列同源性为99％，其编码的氨基酸同源性为99％。     

杂交牛(大额牛×云南黄牛)朊蛋白基因 的分子克隆及其序列分析

朊蛋白(prion protein,PRNP)基因编码朊蛋白,是引起疯牛病的主效基因。本研究利用PCR方法首次从杂交牛(大额牛×云南黄牛)基因组中扩增了PRNP基因,GenBank登录号为HQ875337。PCR产物直接双向测序表明,该序列包含杂交牛PRNP基因795 bp的开放阅读框(ORF),编码264个氨基酸前体蛋白。生物信息学分析结果发现,该蛋白包含1个信号肽、3个α螺旋、2个β折叠、6个八肽重复序列、1个疏水区域、1个二硫键和1个糖基磷脂酰肌醇锚定位点。与已报道的其他牛PRNP基因进行序列比对分析,核苷酸和氨基酸的同源性均在97%以上。     

Technical note: determination of alleles of the ovine PRNP gene using PCR-single-strand conformational polymorphism analysis

Susceptibility to scrapie in sheep is linked to variation at codons 136, 154, and 171 in the host prion protein gene (PRNP). A number of techniques are available for detecting these polymorphisms, but none allow for a rapid and accurate determination of genotype. Here we describe PCR coupled with single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis, which allows for the accurate identification of ovine PRNP alleles. A gene region including codons 136 to 171 was amplified by PCR, and the amplimers were then denatured and subjected to electrophoresis in a nondenaturing polyacrylamide gel. Nine unique SSCP patterns, representing nine different alleles of the ovine PRNP gene, could be resolved. A new polymorphism (I/T) at codon 142 also was detected. The profiles produced by SSCP allowed for the accurate differentiation of PRNP alleles and could be employed to genotype PRNP in sheep.     

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列，设计合成3对引物，对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，分别呈3条531、888和949 bp的特异条带，将其分别克隆人pMD-18T载体中，进行序列测定并拼接序列，得到完整的gag基因序列。分析结果表明，与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．0%，推导出的氨基酸同源性为90％。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为86．3％，氨基酸同源性为87％。     

梅花鹿朊蛋白基因(PRNP)的克隆及序列分析

根据GenBank中鹿朊蛋白基因序列设计特异性扩增引物，采用PCR方法从中国梅花鹿基因组中扩增得到梅花鹿的朊蛋白基因，采用PCR产物直接测序，并将其克隆到pGEM—TEasy载体中测序进行进一步确认，通过分析表明所克隆的梅花鹿朊蛋白基因的ORF基因片段包含771bp，编码256个氨基酸的前体蛋白，相对分子质量约为28200。与已报道的其他品种鹿朊蛋白基因序列进行对比分析，核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98％以上。本试验为进一步研究中国梅花鹿朊蛋白的多态性提供了数据。     

4个绵羊品种Leptin基因部分片段的SNPs分析

利用PCR-SSCP技术对萨福克、道塞特、特克塞尔及滩羊4个绵羊品种358个个体Leptin基因2、3外显子进行多态性分析,共检测到7个SNPs,其中新发现5个SNPs。测序结果表明,在外显子2上无突变。内含子2上存在99位碱基由A突变为G;115位碱基由G突变为A;150位碱基由C突变为T;171位碱基由C突变为T。外显子3上,存在271位碱基由G突变为A,使编码的Arg转变为Gln;316位碱基由C突变为A,使编码的Pro转变为Gln;387位碱基由G突变为T,使编码的Val转变为Leu。     

吐鲁番黑羊MC1R基因序列分析研究

为研究黑皮质素受体1（MC1R）基因对吐鲁番黑山羊毛色的影响,试验采用PCR扩增和测序技术,对吐鲁番黑羊MC1R基因编码区核苷酸序列及其与毛色的相关性进行了研究。结果表明：MC1R基因编码区核苷酸序列954 bp,编码317个氨基酸,编码区存在2个错义突变（c.218 T〉A,p.73 Met〉Lys;c.361 G〉A,p.121 Asp〉Asn）和3个同义突变（c.429 C〉T,p.143 Tyr〉Tyr;c.600 T〉G,p.200 Leu〉Leu;c.735 C〉T,p.245 Ile〉Ile）。SNPs分析表明,单倍型AATGT数量占62%。初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。     

蒙古绵羊Bcl-2基因3’端 cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊Bcl-2基因3’端,根据GenBank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA ,采用RT-PCR 技术扩增出Bcl-2的cDNA ,并重组到PMD18-T 载体,经限制性内切酶谱分析和DNA 序列测定, 证实所克隆的cDNA 为Bcl-2,因为该cDNA 包含由261个碱基组成的开放读码框(ORF) ,该ORF 编码83个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列的同源性为95.8%。     

哈萨克羊INHβA基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆哈萨克羊抑制素βA （inhibin beta A，INHβA）基因序列，并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中绵羊INHβA基因序列（登录号：NM_001009458.1）设计1对特异性引物，通过RT-PCR方法对哈萨克羊INHβA基因进行扩增，将获得的INHβA基因片段插入到pMD19-T载体中进行克隆测序，并结合生物信息学方法预测和分析其核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白跨膜、蛋白修饰位点及二级结构、三级结构模型等。结果显示，哈萨克羊INHβA基因长1 278 bp，编码425个氨基酸。哈萨克羊INHβA基因与绵羊、牛、野猪、小鼠、人、大鼠、猫、兔、马的同源性分别为98.6%、97.7%、90.4%、87.9%、91.1%、88.2%、91.8%、89.8%和91.8%，表明INHβA基因在不同物种之间具有较高的保守性。INHβA蛋白分子式为C₂₀₇₂H₃₃₂₅N₆₀₃O₆₂₈S₂₆，分子质量为47.57 ku，理论等电点（pI）为7.87，不稳定系数为66.16，脂溶指数为78.47，亲水值为-0.507。INHβA是一种碱性不稳定的亲水性脂溶性蛋白，没有跨膜结构，含有信号肽。二级结构预测显示，INHβA蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占22.59%、4.47%、54.12%和18.82%。三级结构预测显示，INHβA蛋白以α-螺旋为主，是含有8种蛋白修饰位点的β-桶状蛋白。本试验结果为深入研究哈萨克羊INHβA蛋白功能及探讨INHβA基因对提高哈萨克羊繁殖力的影响提供参考数据。