海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析

[目的]研究海岛棉与陆地棉纤维不同发育时期C4H1基因的表达和结构差异.[方法]分别从海岛棉和陆地棉纤维中克隆C4H1基因的cDNA全长,并利用DNAMAN、MEGA3.1等软件进行C4H1基因的生物信息学分析;采用半定量和实时荧光定量PCR方法,比较海岛棉和陆地棉不同发育时期的棉纤维中C4H1基因的表达水平.[结果]C4H1基因在海岛棉与陆地棉纤维发育不同时期表达具有差异,海岛棉中该基因的表达高峰期在20 DPA,而陆地棉中该基因的表达高峰期在15 DPA.该基因的核酸序列在两种棉花中存在差异,并导致其编码蛋白的氨基酸序列也存在差异,且海岛棉C4H1蛋白中Thr(苏氨酸)含量高于陆地棉,蛋白等电点也耍高于陆地棉.[结论]海岛棉中C4H1基因的表达高峰期晚于陆地棉,两个棉种C4H1蛋白氨基酸序列的差异可能导致其理化性质及生物学功能的改变,为发掘海岛棉纤维品质优异基因奠定了基础.     

与棉纤维发育相关基因GhSAMS、GhNLP的克隆、鉴定与定位

 【目的】克隆陆地棉纤维伸长发育相关的基因,并做初步功能验证。【方法】以陆地棉李氏超短纤维突变体Li1li1自交后代野生型li1li1和超短纤维突变体Li1li1开花后4 d的胚珠纤维复合体为探针,通过基因芯片筛选优质材料7235棉纤维伸长、次生壁加厚不同发育时期混合cDNA文库,分离出两个在两种材料中差异表达的cDNA序列。【结果】测序结果表明,两个cDNA均为完整的基因序列,分别命名为GhSAMS（GenBank登录号：EF643509）,GhNLP（GenBank登录号：EF643508）。RT-PCR分析表明：开花后4 d,GhSAMS、GhNLP在陆地棉李氏野生型li1li1纤维中的表达量低于无纤维突变Li1li1。Southern杂交结果表明两个基因在陆地棉基因组中都存在少数拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的140个BC1作图群体,将GhSAMS和GhNLP分别定位在染色体14（D2）和19（D5）上。【结论】克隆了两个棉纤维伸长发育相关基因GhSAMS和GhNLP,推测其高表达阻止纤维伸长生长,为进一步分析功能和用于分子育种打下基础。     

棉纤维起始分化期基因枪介导的GhSuSy表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase)通过调节植物糖代谢介导棉纤维的起始和发育。为进一步研究棉纤维起始分化过程中蔗糖合酶的转录调控机制,克隆了GhSuSy基因5′端上游2 000 bp的启动子片段,构建了含LUC荧光报告基因的重组载体,采用基因枪瞬时转化技术,把重组载体DNA分别转化到棉花叶片和花瓣,比较分析了不同载体膜压力、不同轰击距离与孵育时间等条件下的荧光素酶(luciferase, LUC)活性。用优化后的条件检测了棉纤维起始分化期蔗糖合酶基因GhSuSy偶联的LUC在叶片和花瓣中的活性,并与GhSuSy表达、蔗糖合酶活性比较分析。结果显示：-0.09 MPa真空度下,可裂膜压力设为6.80 MPa,载体膜距离叶片7 cm,轰击2次转化效率最高,转化后样品孵育16 h左右LUC荧光信号最强;与叶片中LUC表达相比,花瓣中LUC荧光信号强、活性高,特别是开花当天(0 d)和开花后1 d(1 DPA)差异明显;在纤维起始分化的开花前3 d(-3 DPA)到开花后3 d(3 DPA),叶片和花瓣中LUC活性先升高后降低,在0和1 DPA的LUC活性最高,这一结果与GhSuSy的...     

利用基因芯片分析比较Giza75和SG747纤维发育差异表达基因

【目的】 利用适应性广、产量高的陆地棉和纤维品质优异的海岛棉进行高通量基因芯片比较分析,筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】 以SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium barbadense L.)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 d(10 days after anthesis, 10 DPA)的棉纤维进行表达谱分析。【结果】 材料Giza75和SG747共筛选到3 905个差异表达基因,其中功能预测基因占比17.80%,翻译、核糖体结构相关基因占比16.82%,翻译后修饰占比14.32%。Gra.2198.1.A1_at正向调控棉纤维发育过程,Gra.85.1.S1_at、Ghi.249.1.A1_at和Ghi.8448.1.S1_x_at负向调控棉纤维发育过程,可能参与了棉纤维发育过程。【结论】 利用陆地棉和海岛棉基因芯片并结合qRT-PCR筛选和鉴定到4个纤维发育相关的关键候选基因。     

陆地棉GhDGAT1基因干涉载体构建与遗传转化

二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是生物体内三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究克隆陆地棉GhDGAT1基因308bp片段,构建了该基因含内含子结构的hpRNA干涉载体;应用花粉管通道法转化棉花,研究内源基因GhDGAT1沉默对棉花油分含量的影响。结果表明:1)经PCR及Southern杂交鉴定,转基因种子中GhDGAT1基因表达量受到显著抑制,种仁含油量下降,最多下降3.13%。2)种子油脂量显著减少的株系中,总蛋白含量及可溶性糖分含量,分别相对提高4.31%～9.77%和11.67%～23.01%。3)与野生型相比,转基因株系幼胚在发育后期鲜重降低,而可溶性蛋白含量升高。4)与对照相比,转基因植株的株高、第一果枝高度、果枝数均显著降低,但其他农艺性状与主要的经济性状均未受到显著影响。研究表明,通过调控GhDGAT1基因的表达可影响陆地棉的油脂合成,调节棉籽油分含量。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

海岛棉与陆地棉不同纤维发育时期苯丙烷代谢相关基因表达差异比较

[目的]比较研究在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中苯丙烷代谢相关基因(PAL和4CL)表达模式的差异.[方法]利用荧光定量PCR,检测不同品种来源纤维在不同发育时期目的基因表达量.[结果]发现PAL1及4CL1基因的表达量随纤维发育天数的增加而增加,在陆地棉军棉1号中,基因表达量在15 DPA达到最高,而在海岛棉新海20号中PAL1及4CL1基因的表达高峰期则为20DPA.[结论]发现PAL1基因与4CL1基因的表达模式在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中出现差异,海岛棉中两个基因的表达高峰期均晚于陆地棉,为逐步揭示海岛棉和陆地棉纤维品质差异的分子机理奠定了一定实验基础.     

过表达棉花葡萄糖醛酸激酶基因GbGlcAK促进拟南芥细胞伸长

纤维品质改良一直是棉花育种的重要目标。基于纤维不同发育时期的RNA-seq数据，发现1个在海岛棉和陆地棉间差异表达的葡萄糖醛酸激酶基因（glucuronic acid kinase/glucuronokinase，GlcAK）。从海岛棉（Gossypium barbadense）Pima90-53纤维中克隆了GbGlcAK，其ORF为1 101 bp，编码366个氨基酸。GbGlcAK具有GHMP 激酶 N和C结构域，为GHMP超家族成员，属于可溶性非分泌蛋白，与拟南芥GlcAK亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示GbGlcAK分布在细胞质中。超表达GbGlcAK的拟南芥叶表皮毛、下胚轴、下胚轴细胞和根的长度较野生型均极显著增加，UDP-D-GlcA代谢相关基因表达量增加，果胶含量显著增加，说明过表达GbGlcAK能够上调UDP-D-GlcA代谢通路相关基因的表达从而提高果胶含量，进而促进细胞伸长，这为进一步研究GbGlcAK在棉纤维发育中的功能提供了参考。     

棉花SBP家族基因的鉴定与分析

为研究棉花Squamosa启动子结合蛋白(SBP)家族成员的结构和功能,利用生物信息学方法,从棉花全基因组数据库中筛选并鉴定出83个棉花SBP家族成员,命名为GhSBP1—GhSBP83。并对该家族成员的蛋白质理化性质、多序列比对、系统进化树、基因染色体分布、基因结构、基因表达模式进行了全面分析。结果表明,棉花SBP转录因子家族可以分为8个亚族。棉花SBP基因分布在1—8号染色体以及11—13号染色体上。对NCBI中陆地棉的EST数据库进行比对分析,结果显示,40个棉花SBP转录因子家族成员在棉花的分生组织、茎、花、花芽、花药以及棉纤维中广泛表达。其中,GhSBP2、GhSBP4、GhSBP6等20多个基因在花药和棉纤维中均有表达,推测花药和棉纤维的生长发育可能同时受这些基因的控制。     

植物UGD基因家族系统发育分析及在棉纤维中的表达分析

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-glucose dehydrogenase,UGD)是植物细胞壁合成的主要前体物质。本研究利用生物信息学方法分析了15个植物基因组中UGD基因家族的基因结构,系统进化,以及其中7个双子叶植物的种内共线性,染色体定位。利用荧光定量PCR方法分析了UGD家族基因在陆地棉棉纤维不同发育时期的表达。结果表明:15个物种中共鉴定出56个UGD基因,可聚为2个进化群,藻类单独成一个群,其他植物构成一个群,各物种均有UGD家族基因的特异进化枝。藻类植物UGD家族均含有内含子。大片段复制是UGD家族基因扩增的主要动力。12个陆地棉UGD基因在棉纤维不同发育时期均有表达,多数基因在20DPA或25DPA基因表达量较高。     

荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式

棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。     

鸡胚NANOG、POUV和TWIST2基因不同发育阶段表达谱分析

为了解析鸡胚发育过程中NANOG、POUV和TWIST2基因的调控作用,利用荧光定量RT-PCR方法,研究NANOG、POUV和TWIST2基因在孵化1~6d(E1~E6)的整体胚胎和孵化15和18d(E15、E18)鸡胚的大脑、心脏、肝脏和左侧大腿肌肉组织中的表达谱。结果表明,1)NANOG基因的表达水平在E2~E6整胚和E15、E18胚期的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均极显著低于E1时期(P0.01)。2)在鸡胚发育的整胚E1~E6和E15、E18时期的大脑、肝脏、心脏和腿肌中,POUV基因的表达水平基本呈现逐渐降低趋势,且从E3时期后均显著低于E1时期(P0.05或P0.01)。3)TWIST2基因在E1~E6整胚中的表达水平呈现逐渐增高趋势,到E6达到最高水平(P0.05或P0.01);在E15和E18时期的上述4种组织中又呈现降低趋势,但均高于E1时期。NANOG、POUV和TWIST2基因在鸡胚发育过程的调控水平存在差异,研究结果可望为鸡的育种和临床研究提供资料。     

海岛棉GbMYB25基因的克隆及表达分析

根据陆地棉GhMYB25的序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术从海岛棉品种新海21号中克隆了1个同源基因,命名为GbMYB25。GbMYB25基因具有1个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,预测分子量约为34.762ku,等电点为8.08,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GbMYB25基因序列包含2个内含子。氨基酸序列比对表明,该蛋白和其他高等植物的MYB蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GbMYB25基因和陆地棉GhMYB25基因处在同一进化树分支。亚细胞定位表明GbMYB25基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明GbMYB25基因在胚珠(0doa)、纤维(5dpa)和叶片中的表达量较高。以上结果表明,GbMYB25转录因子可能参与棉花纤维发育。     

Isolation and Expression Analysis of Two Genes Encoding Cinnamate 4-Hydroxylase from Cotton （Gossypium hirsutum）

Two genes （GhC4H1 and GhC4H2） that encode putative cotton cinnamate 4-hydroxylases that catalyze the second step in the phenylpropanoid pathway were isolated from developing cotton fibers. GhC4H1 and GhC4H2 each contain open reading frames of 1 518 base pairs （bp） in length and both encode proteins consisting of 505 amino acid residues. They are 90.89% identical to each other at the amino acid sequence level and belong to class I of plant C4Hs. GhC4H1 and GhC4H2 genomic DNA are 2 247 and 2 161 bp long, respectively, and contain two introns located at conserved positions relative to the coding sequence. GhC4HI and GhC4H2 promoters were isolated and found to contain many cis-elements （boxes P, L and AC-1 element） previously identified in the promoters of other phenylpropanoid pathway genes. Histochemical staining showed GUS expression driven by the GhC4H1 and GhC4H2 promoters in ovules and fibers tissues. GhC4H1 and GhC4H2 were also widely expressed in other cotton tissues. GhC4H2 expression reached its highest level during the elongation stage of fiber development, whereas GhC4H1 expression increased during the secondary wall development period in cotton fibers. Our results contribute to a better understanding of the biochemical role of GhC4H1 and GhC4H2 in cotton fiber development.     

Molecular Identification and Expression Analysis of GhHYDRA 1 Gene,a Homologue of HYDRA1 Gene From Upland Cotton （Gossypium hirsutum L.）

Beside as precursors of BRs biosynthesis,more and more evidences supposed that phytosterols play an important role in plant growth and development.To investigate the effects of phytosterols on the fiber development of upland cotton(Gossypium hirsutum L.)and the molecular base of sterol regulating cotton fiber growth,a homologue of HYDRA1 was cloned from upland cotton(cv.Xuzhou 142)by screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs.The GhHYDRA1 encoded a polypeptide of 218 amino acid residues and the deduced amino acid sequences had high homology with the members of HYDRA1 in Populus trichocarpa,Solanum tuberosum,and Arabidopsis thaliana.Moreover,GhHYDRA1 had comparable transmembrane regions to AtHYDRA1 in sequence,length,order,and spacing,except for a C-terminal polylysine cluster.Quantitative real-time RT-PCR analysis revealed that the higher expression levels of GhHYDRA1 gene were detected in 6 to 12 DPA(days post anthesis)fibers,while the lower levels were observed in 0 DPA ovule(with fibers)and 16 to 18 DPA fibers.These results indicated that GhHYDRA1 is the homologue of HYDRA1 gene and plays a crucial role in fiber elongation.Furthermore,auxin and BL up-regulated the expression level of GhHYDRA1 while ABA and KT down-regulated the expression level of GhHYDRA1 in cotton ovule and fiber growth.The result suggested that phytosterols play a role in the interaction of plant hormones.     

猪胚胎附植期Eph A4的组织表达及其多态性对产仔数的影响

为研究Eph A4对猪繁殖性能的影响,在猪妊娠第13天(附植前期)、第18天(中期)和第24天(后期),用PCR-SSCP方法检测了7个品种的950头母猪群中Eph A4基因的多态性,检测了Eph A4基因在大白猪子宫内膜等组织中的mRNA和蛋白表达量,并与猪的产仔数进行了关联分析.结果表明:Eph A4基因在子宫内膜附着点的mRNA表达量要高于任何其他组织的,且妊娠第13、18和24天的表达量差异不显著,但妊娠猪极显著低于空怀猪的(P＜0.01);Eph A4的蛋白表达量在附植前、中和后期的表达量两两间差异均显著(P＜0.05),且妊娠第18天最高,妊娠第24天最低.Eph A4基因第3外显子上检测到了2个突变位点EphA4_1和EphA4_2.EphA4_1是一个A→G的突变,使谷氨酸变成了赖氨酸,G为优势等位基因,且GG基因型关联的产仔数显著高于AG或GG基因型的(P＜0.05);EphA4_2是一个T→C的突变,C为优势等位基因,且CC基因型关联的产仔数显著高于TC或TT基因型的(P＜0.05).上述结果表明,Eph A4的表达对猪的胚胎附植发挥着一定的调控作用,EphA4_1位点GG基因型和EphA4_2位点CC基因型可以作为产仔数性状的标记基因型.     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。