减蛋综合征病毒(EDS_(76))的分离和鉴定

鸡减蛋综合征是由腺病毒引起的鸡的主要传染病之一,自1976年国外首次发现该病以来,已在包括我国在内的许多国家流行,给养禽业造成巨大的经济损失。2005年黑龙江省绥化市一个体养鸡场的190日龄商品蛋鸡突然出现产蛋下降,从发病鸡的输卵管中分离到一株具有血凝性的病毒。经过HI试验、AGP试验、理化特性和PCR序列扩增及测序,证明分离到的病毒是一株EDS_(76)V。     

鸡减蛋综合征病毒的分离与鉴定

从产蛋率下降．出现软壳蛋、薄壳蛋等畸形蛋的鸡场采集病料，接种鸭胚后分离到1株病毒，经过电镜观察，脂溶剂敏感性试验、HA试验、HI试验、AGP试验，分离病毒被鉴定为EDS-76病毒。     

用全血平板凝集抑制试验快速诊断鸡减蛋综合症(EDS_(76))

利用鸡产蛋下降综合症(EDS_(76))病毒具有凝集红细胞的特性,建立了全血平板凝集试验。用各种不同血凝价的病毒制备平板抗原,通过方阵试验,确定了全血平板凝集抑制试验抗原的测试单位。该法具有较高的阳性检出率,而且具有比现有的血凝抑制试验(HI)和琼脂扩散沉淀试验(AGP)更快速、更简便易行的优点,适用于基层单位的推广应用,尤其适于净化种鸡群,淘汰阳性种鸡。     

鸡减蛋综合症病毒（EDS—76）的分离与鉴定

采取新疆五家渠某鸡场发病鸡病料，接种鸭胚，分离病毒，病料在鸭胚中盲传至第５代，鸭胚尿囊液ＨＡ效价达２１７，ＨＡ可被ＥＤＳ－７６标准阳性血清抑制。免疫电镜观察到了病毒颗粒，表明该病是由ＥＤＳ－７６病毒所致     

减蛋综合征病毒单克隆抗体的生物学特性鉴定

该研究在建立分泌减蛋综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的基础上，鉴定了１０株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体（４Ｂ１，１Ｄ４，２Ｄ６，３Ｄ６，２Ａ１，３Ａ５，３Ｃ６，３Ｃ１，１Ｂ３和２Ｃ５）和生物学活性，这１０株杂交瘤细胞分泌的抗体有高度的特异性，只特异地作用于减蛋综合征病毒，微量血凝抑制试验（ＨＩ）发现４Ｂ１，３Ｃ１，２Ｃ５和３Ｃ６有血凝抑制活性，腹水效价分别为２４（ｌｏｇ２），４（ｌｏｇ２），７（ｌ     

减蛋综合征AQ毒株的分离与鉴定

通过鸭胚接种，从发生产蛋下降、产畸形蛋的鸡群中分离到一株病毒ＡＱ毒株。该病毒能在鸭胚和鸭胚成纤维细胞上生长，并能引起明显的胚体病变和细胞病变，对鸡红细胞的凝集作用能被ＥＤＳ７６标准阳性血清所抑制；病毒对氯仿不敏感、耐酸（ｐＨ３．０）、对热（５０℃３０ｍｉｎ）稳定，核酸型为ＤＮＡ，电镜观察见直径约７０～７５ｎｍ的圆形病毒颗粒。初步鉴定ＡＱ株是鸡减蛋综合征病毒。     

减蛋综合征1976病毒单克隆抗体的制备及其初步鉴定

采用经层析方法提纯的减蛋综合征１９７６（ＥＤＳ‘７６）病毒免疫ＢＬＡＢ／ｃ小鼠。最后一次加强免疫后第３ｄ制备脾脏细胞，然后用５０％的聚乙二醇（ＰＥＧ，分子量４００）融合脾脏细胞和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞。通过选择培养、特异性抗体检测、筛选和克隆詈笾票赋觯抵攴置诳固宓南赴辏停玻停常停保埃停保春停停保怠Ｎ⒘垦种剖匝椋ǎ龋桑┲っ鳎停保档タ寺】固寰哂醒种苹钚裕龋杉畚叮ǎ欤铮纾玻     

鸡产蛋下降综合症（EDS_（－76））Z_（16）毒株的分离和鉴定

从５个爆发产蛋下降综合症的鸡场收集８０个样品中，分离到５株具血凝性的病毒，命名为ＣＡＶ—Ｚ＿（１６）、Ｚ＿２、Ｗ＿４、Ｔ＿１和Ｔ＿３株。病毒大小７０～８０ｎｍ，无囊膜，二十面体对称；对氯仿不敏感，ｐＨ３～５下稳定，５０～６０℃１小时不被完全灭活；在ＤＥＦ细胞上繁殖能被ＩＵＤＲ抑制；经血凝抑制试验、琼扩试验和微量中和试验证实与ＡＶ—１２７株属同一血清型，鉴定为ＥＤＳ＿（－７６）病毒。ＣＡＶ—Ｚ＿（１６）株能在鸭胚上繁殖，致死鸭胚，ＨＡ效价达２￣（１３）～２￣（１７），也能在鸭胚成纤维细胞上繁殖，产生ＣＰＥ，但ＨＡ效价仅有２￣７～２￣（１０）。初次分离ＥＤＳ＿（－７６）病毒选用鸭胚较佳，从生殖道分离成功率较高。     

新城疫病毒和减蛋综合征病毒同鸭胚增殖的研究

鸭源新城疫病毒（ＮＤＶ－Ｄ１０）和减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）可以在鸭胚中同时良好增殖，两种病毒的血凝价分别与单独接种时一致；同胚增殖病毒对鸭胚或ＳＰＦ鸡胚的感染能力和致病性分别与单独接种组无显著差异；利用同鸭胚增殖病毒的尿囊液制备的二联油乳剂灭活疫苗接种免疫鸡可以分别抵抗ＤＮＶ强毒和ＥＤＳＶ强毒的攻击。     

减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定

根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒分离与鉴定

在对国内某地区７个患病猪群流行病学调查的基础上，用Ｍａｒｃ－１４５细胞培养从４个猪群流产胎儿分离到３株导致细胞病变的病毒－Ｊ１，Ｊ２和Ｊ３株。它们对氯仿和热，甲醛，酸，碱均敏感。病毒粒子呈球状，直径３０－８０ｎｍ，负染后病毒粒子大小８０－１００ｎｍ，在Ｍａｒｃ－１４５细胞质内增殖，５－溴－２’－脱氧尿核苷对其元抑制作用。结合血清学试验，鉴定３个毒株均为猪繁殖和呼吸综合征病毒，可能为美洲型ＰＲＲＳＶ     

种番鸭产蛋下降综合征病毒的分离及其PCR鉴定

从临床表现产蛋率下降、产蛋异常的种番鸭输卵管粘膜中分离到1株病毒,经血凝及血凝抑制试验鉴定为产蛋下降综合征病毒,命名为E05。参照GenBank上发表的鸭源产蛋下降综合征病毒基因组序列的保守区设计1对引物,通过PCR技术扩增出286 bp的基因片段,将扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞,筛选出阳性重组质粒进行测序分析。测序结果与GenBank上已发表的EDSV 100kD蛋白序列比对,扩增片段与已登陆的基因片段完全相符,同源性100%。     

PCR方法检测鸡减蛋综合征病毒

根据已报道的鸡减蛋综合征(Egg drop syndrome 1976 EDS-76)病毒DNA序列,设计合成了1对能扩增300 bp DNA片段的引物,建立了EDS-76病毒的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法。该方法对EDS-76病毒标准株AV-127扩增结果为阳性;对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性。结果表明该方法特异且敏感,检测的最低病毒DNA含量达到2.5×10-2pg,PCR检测表明,从试验感染鸡的心脏中不能检测出病毒,肝脏和肾脏只有在感染后7~15 d检出,在试验感染后4~21 d的子宫、血液和4~17 d的脾中均能检测到病毒。     

不同方法提纯鸡减蛋综合征病毒的比较

通过相关系数的计算与显著性检验,结合病毒蛋白浓度的大小,同时进行电镜观察,证实了由鸭胚增殖的ＥＤＳ病毒采用６０％饱和度的硫酸铵或１０％聚乙二醇（ＭＷ６０００）深沉法初提后,再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析法提纯的效果优于ＤＥＡＥ５２纤维素色谱法。     

鸡减蛋综合征病毒基因组提取方法的比较

分别采取PEG-6000沉淀法、酶直接消化法和超速离心法浓缩、纯化减蛋综合征病毒，并提取基因组DNA。结果表明：上述三种方法对1．5mL鸭胚尿囊液(HA≥14(log2))提取的DNA量分别为148．4，189．2和210．4μg；其OD260／OD280值分别为1．702，1．635，1．738，均在1．6～1．8之间，完全符合要求的纯度；经电泳显示，三种方法提取的DNA图谱也完全一致。提示，在无超速离心机的条件下，酶直接消化法和PEG-6000沉淀法提取的EDSV基因组DNA在纯度和数量方面，完全可以满足分子生物学的研究需要，且利用PEG-6000沉淀法，在时间、设备和试剂方面更为节简，可作为一般实验室操作时的首选方法。     

鸭源新城疫病毒和减蛋综合征病毒在同一鸭胚中增殖的观察

用鸭源新城疫病毒（ＮＤ）Ｄ１０株和减蛋综合征（ＥＤＳ—７６）病毒ＧＣ２株同时在同一鸭胚中复制增殖．结果表明：（１）两种病毒同时感染同一鸭胚后，鸭胚平均死亡时间（ＭＤＴ）７３．６ｈ，死亡率８８．２％（１５／１７）．胚体皮肤出血、淤血，绒毛尿囊膜水肿、增厚，尿囊液能凝集人和鸡红细胞．（２）尿囊液感染鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞，致细胞病变（ＣＰＥ），证实尿囊液中存在ＮＤＶ．用间接法Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ—７６病毒抗原，结果为阳性．（３）电镜观察经提纯浓缩后的尿囊液，可见到两种病毒粒子：ＮＤＶ形态不一，多数直径约１２０～１３０ｎｍ或更大．有囊膜；ＥＤＳ—７６病毒呈圆形，直径约７０ｎｍ，有囊膜．（４）用血凝试验（ＨＡ）测定两种病毒．其生长规律与单独接种时一致．（５）接种灭活的含毒尿囊液的雏鸡，在血清中出现抗两种病毒的ＨＩ抗体及抗ＥＤＳ－７６病毒的中和抗体，对ＮＤＶ强毒攻击有坚强的免疫力。     

慎防蛋鸡减蛋综合征

一、临诊症状被感染的鸡群为180日龄,发病初期,鸡群整体精神状态很好,没有明显的疾病症状,饮食正常,只是表现为产蛋率显著下降,产出的蛋颜色消褪,褐色蛋常变浅或变成白色,薄壳蛋和软壳蛋数量增多,蛋清粘度降低,呈水样,个别鸡出现腹泻,偶尔有