梨废渣发酵生产菌体蛋白的研究

梨废渣（包括梨皮和梨核）营养物质含量丰富，却常作为废物丢弃，造成资源浪费。为进一步开发菌体蛋白的生产原料，本研究以梨废渣为原料，酿酒酵母为菌种进行发酵试验，通过响应面分析法对生产菌体蛋白的发酵工艺进行优化。在单因素试验基础上，以菌体蛋白含量为响应值，对尿素添加量、接种量、搅拌次数和发酵时间4个因素进行Box-Behnken试验设计及优化，分析各因素及其相互间的交互作用对菌体蛋白含量的影响。结果表明：梨废渣的最佳发酵条件为：尿素添加量8.4%，接种量6%，搅拌次数3次，发酵时间3.35 d，在此条件下菌体蛋白含量为5.62%。 [关键词] 梨废渣|菌体蛋白|酿酒酵母|响应面     

分段式补料批次发酵对凝结芽孢杆菌发酵水平的影响

试验采用分段式补料批次发酵技术对1株畜禽用凝结芽孢杆菌的发酵水平进行了研究,对数期补料促使菌体量大量积累,稳定期补料促进芽孢大量形成,从而达到高菌体量和高芽孢率的目的。试验结果表明,对数期补加淀粉量为总淀粉量的10%,豆粉和鱼粉(质量比为2:1)补加量为总豆粉和鱼粉量(质量比为2:1)的5%,补加方式为2次等量补加(间歇10～12 h),发酵水平由分批发酵6.80×10⁹ CFU/mL提高到8.30×10⁹ CFU/mL;稳定期最佳补料浓度为0.10 g/L碳酸钙、0.156 g/L磷酸二氢钠、0.30 g/L蛋氨酸,最佳补料方式为1次性补加,经稳定期补料优化,芽孢率由分批发酵的75.78%提高到85.63%。因此,采用分段式补料批次发酵技术能够进一步提升发酵液的菌体数和芽孢率。     

不同培养方式对副猪嗜血杆菌发酵的影响

本研究采用分批培养及分批补料培养方式进行副猪嗜血杆菌的发酵培养,以提高其菌体生物量。本试验首先分析了副猪嗜血杆菌分批培养的发酵过程,然后采用分批培养、恒速流加分批发酵、pH反馈流加分批发酵3种培养方式进行副猪嗜血杆菌发酵培养。结果显示利用恒速流加分批发酵方式进行副猪嗜血杆菌发酵时活菌数最高,为1.6×10¹⁰ CFU/mL,表明采用分批补料培养方式可明显地提高副猪嗜血杆菌的活菌数,且为分批培养的3~4倍。     

饲用木聚糖酶固态发酵工艺条件研究

木聚糖酶作为饲料添加剂,可以强化禽畜消化道分解饲料的功能,促进营养物质的吸收。通过单因素试验和正交试验对黑曲霉A-3固态发酵生产饲用木聚糖酶的工艺条件进行了研究。优化的发酵条件如下:采用麸曲种子接种,接种量为10%;装料量为5g/300ml三角瓶、初始pH值为5.5、培养温度为35℃、料水比为1:1.5、培养时间为84h。在优化条件下,菌株产木聚糖酶活力达8291.75IU/g,比优化前提高了63.73%。     

产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究

本试验以表达鸡α干扰素的毕赤酵母工程菌为研究对象,在50 L发酵罐水平,研究p H、装液量、溶氧、诱导条件等因素对发酵产鸡α干扰素的影响。确定了最优发酵工艺为菌体增殖阶段:控制p H为6.0,溶氧控制在30%～40%,诱导前菌体浓度为400 g/L,诱导时控制pH为5.5,溶氧控制在20%～30%,用50%质量浓度的山梨醇:甲醇=1:4的诱导剂,采取连续补料方式,诱导初期补料速度为1 mL/(L·h),每小时提升一个单位,5 h后控制流加速度为5～6 m L/(L·h)。此工艺条件可实现500 L规模发酵生产鸡α干扰素,并且工艺稳定,鸡α干扰素的抗病毒活性可达到4.5×107U/mL以上,生产成本降低55%,发酵效价提高了3.5倍,并且控制简单,适合规模化生产。     

加减四君子汤混菌发酵工艺参数研究

为考察加减四君子汤混菌发酵过程中的影响因素,通过单因子试验及正交试验,确定其最佳发酵工艺。以发酵产物中菌体含量为指标,采用枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、嗜酸乳杆菌3种菌种混合对加减四君子汤进行固态发酵。结果表明,最佳发酵工艺条件为:发酵温度31℃、接种量4%、发酵时间72 h、初始pH值6.0在此条件下,菌体含量为2.23×10~8CFU/mL,发酵效果较好,为复方中药混菌发酵工艺的开发提供参考。     

枯草芽孢杆菌诱变株发酵羽毛工艺条件的研究

通过对枯草芽孢杆菌紫外线和亚硝酸钠复合诱变菌株FUN30.2的发酵培养基及发酵条件的优化,得到最优的发酵培养基成分为:羽毛粉5.5%,青贮玉米秸秆粉0.8%,K+浓度0.018mol/L,Mg2+浓度0.065mol/L,Ca2+浓度0.072mol/L,Fe2+浓度0.010mol/L,Na+浓度0.088mol/L。最优的发酵条件为:培养温度33℃,培养时间72h,摇床转速170r/min,接种量6%,装液量100mL/500mL,菌体生长适宜的培养基初始pH值是7.0,菌体产酶的最适宜pH值为7.5～8.0。60h菌体产酶活力最高达1.267U/mL;发酵时间72h,羽毛降解率为69.61%;发酵液的氨基酸含量达22.66mg/mL。     

发酵性接合酵母的富硒能力分析与发酵条件优化

本试验以实验室保存的发酵性接合酵母为出发菌株,采用3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐法测定不同发酵条件下酵母菌的硒含量,并通过单因素试验和正交试验研究了发酵时间、装液量、硒浓度、接种量对酵母菌富硒能力的影响。结果表明:酵母发酵的最佳条件为发酵时间36 h,装液量60 m L/250 m L,接种量12%(V/V),加硒时间8 h。此条件下富硒酵母的生物量可达5.96 g/L,总硒含量达10.10 mg/L。     

猪致病性大肠杆菌高密度发酵工艺的研究

为了提高猪致病性大肠杆菌(O139血清型)的生产量,缩短生产周期,降低生产成本,首先在10L发酵罐中对影响大肠杆菌发酵的pH值、相对溶氧量、生物量、氨基氮、还原糖、无机磷测定等方面进行了单因子试验优化。研究表明,大肠杆菌在37.5℃,pH值为7.5,4%的接种量,溶氧量为50%,200r/min的转速以及15g/L的葡萄糖添加量,20g/L的氨基氮添加量,100mmol/L的无机盐添加量,培养18h后可以得到理想的培养效果。利用此优化的条件,结合兽医药品GMP原则,在200L发酵罐中进行了发酵试验,结果在发酵结束后菌液的OD600可以达到34.51,相当于菌体浓度为12.94g/L,从而得到了大肠杆菌工业化生产工艺,为大肠杆菌疫苗大规模生产奠定了基础。     

益生菌枯草芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化

试验对枯草芽孢杆菌4#的发酵培养基和发酵条件进行筛选优化.通过单因素试验及正交试验方法,确定该枯草芽孢杆菌4#的优化培养基为0.5 %葡萄糖、0.3 %淀粉、3 %豆粕、3.08 %硫酸锰0.2 mL、0.3 %磷酸氢二钾、0.15 %磷酸二氢钾、0.05 %硫酸镁、0.02 %酵母膏、0.01 %氯化铁和0.01 %碳酸钙.最适发酵条件为初始pH 7.2,发酵温度30 ℃,摇床转速220 r/min,接种量10 %.进行发酵罐放大培养,最佳放罐时间18～20 h,获得的菌体数量约128亿个/mL.     

地衣芽孢杆菌M109高密度发酵条件的优化

试验旨在筛选一株地衣芽孢杆菌M109(Bacillus licheniformis M109)进行培养基和发酵条件的优化。采用单因素试验方法筛选出最佳碳源和氮源的培养基,并利用正交试验方法确定其最佳的碳氮比。为了继续提高地衣芽孢杆菌M109的发酵水平,研究其在发酵过程中的生长曲线、pH和溶氧(DO)水平的变化曲线,通过对发酵过程中生长参数的测定,优化了地衣芽孢杆菌M109最佳的接种量和最适pH。结果发现,溶氧限制是地衣芽孢杆菌M109生长的关键因素;在限定通风量的条件下,通过调节搅拌转速的方法来提高培养基中的溶氧水平,提高发酵密度;通过流加培养基的方法也能提高地衣芽孢杆菌M109的发酵水平。因此,通过对培养基和发酵条件的优化,使地衣芽孢杆菌M109的发酵水平由最初的1.0×10⁹ CFU/mL提高到1.2×10¹⁰ CFU/mL,芽孢形成率为88%。     

粪肠球菌生长曲线的测定及其对小鼠脑组织的影响

为测定致羔羊脑炎粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的生长曲线，寻求一种快速而准确的方法测定不同生长时期粪肠球菌数量，并客观评价其毒性强弱及其对小鼠脑组织的影响，试验采用平板菌落计数法和OD-Monitor振荡比浊法（D_λ值法）测定粪肠球菌的生长曲线，探究该菌在合适时间段内的吸光值（D_{600 nm}）与平板菌落计数法测定的活菌数（CFU）的关系。用粪肠球菌感染小鼠，观察记录小鼠的死亡情况，最后采用Karber法计算粪肠球菌感染小鼠的半数致死量（LD₅₀）。用LD₅₀的剂量感染小鼠，及时采集死亡小鼠脑组织，未死亡的小鼠72 h后全部剖杀取脑组织，一部分做涂片染色，制作病理切片，观察病理变化；一部分进行培养，用于PCR方法进行细菌的回收鉴定。结果显示，用两种方法测定此株粪肠球菌的生长曲线基本一致，在2~8 h生长迅速，为对数生长期，8~14 h生长缓慢，为稳定期，14 h之后死亡数增加，进入衰亡期；对12 h粪肠球菌D_{600 nm}与CFU的关系进行探讨，成功建立回归方程：y=20.769x-1.3422，R²=0.997；其感染小鼠的LD₅₀为7.77×10¹¹个活菌。以此剂量感染小鼠，脑组织涂片染色和培养染色，均能看到革兰氏阳性球菌；PCR结果显示，均出现了大小为112 bp的条带。对脑组织进行病理学观察发现该菌可导致脑组织充血、出血、形成微血栓，脑膜充血。通过生长曲线和其D_{600 nm}与CFU关系的建立，可实时监测粪肠球菌数量，为后期更深入研究粪肠球菌穿越血脑屏障的机制奠定重要的理论基础。     

蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌协同发酵豆粕工艺条件优化

试验研究了不同发酵条件对发酵豆粕品质的影响,采用单因素优化,逐级递进法,对豆粕发酵条件进行了优化。以豆粕为原料,以益生蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌作为发酵菌种进行固态发酵试验研究,主要考察其对发酵产物酸溶蛋白和总有机酸的影响。结果表明,豆粕固体发酵最优工艺条件为:发酵菌种比2:1(蜡样芽孢杆菌菌液:粪肠球菌菌液=2:1)、发酵初始含水量45%,发酵时间54 h、好氧与厌氧时间比2:1,在此发酵条件下酸溶蛋白达到14.95%、总有机酸2.47%、抗原蛋白降解率在90%以上。     

猪肺炎支原体HN0613株高密度发酵工艺研究及效力评价

旨在建立猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）HN0613株高密度发酵工艺技术。以培养滴度（CCU）作为考查指标，确定Mhp HN0613株的最佳活力代次以及复苏培养时间；通过四因素三水平正交试验筛选最佳基础培养基配方；以通气量、搅拌转速和接种百分比作为单因素考查指标，优化15L发酵工艺参变量，并确定700L高密度发酵放大工艺；按照确定的高密度发酵工艺技术，制备MhpHN0613株灭活疫苗，评价其对兔和仔猪的免疫效力。结果表明，Mhp HN0613株F11代较其他代次CCU水平高，可达1×10^9CCU／mL，为最佳活力代次；其在复苏72h后，pH值降为7．0左右，CCU水平达到最高，为1×10^9CCU／mL，为最佳复苏培养时间；培养体系中，2％的初始葡萄糖添加量、8％接种百分比、初始培养基pH值7．6、15％猪血清添加量为最适培养条件；通气量100L／h、搅拌转速300r／min和8％接种百分比条件最有利于Mhp HN0613株15L发酵培养；首次建立了平衡kLa联动pH值回调的工艺技术路线，并将优化后发酵罐搅拌叶轮结构改为推进式叶轮，降低了叶轮对菌体的剪切作用力，CCU较优化前提高了10倍，且培养周期较优化前缩短了2-3d；700L高密度发酵放大工艺中，Mhp HN0613株培养滴度不低于5×10^9CCU／mL．最高可达1×10^10CCU／mL；免疫兔血清抗体效价均不低于1：40，最高可达1：160；免疫组实验仔猪肺炎减少率均高于80％，临床观察精神及食欲未见异常。该研究为Mhp疫苗规模化发酵生产提供了一定的理论依据。     

玉米秸秆与废弃白菜的混贮品质及乳酸菌多样性研究

为研究玉米秸秆和废弃白菜混合青贮可行性,考查二者在不同质量比时的混贮品质,设计了6个不同的混贮比例,分别为29∶19,27∶21,25∶23,23∶25,21∶27和19∶29。混合青贮30 d后对其化学组分和发酵品质进行分析,筛选品质最佳的混贮比例,并进一步研究了品质最佳混贮组的乳酸菌多样性。结果表明,质量比为21∶27的混贮5(ME₅)组的pH和氨态氮/总氮显著低于其余混贮组(P<0.05),乳酸含量显著高于其余混贮组(P<0.05)。ME₅组的干物质和能源组分综纤维素含量较高,而酸性洗涤木质素含量较低,综合判定该组的混贮品质优于其他5组。乳酸菌多样性结果显示,从ME₅组中共分离出10株乳酸菌,分属于3个属,4个种。3个属分别是乳杆菌属、肠球菌属和明串珠菌属。4个种分别是2株短乳杆菌、1株屎肠球菌、5株肠膜明串珠菌肠膜亚种和2株植物乳杆菌,其中同型发酵乳酸菌乳杆菌属和肠球菌属为该青贮体系的关键乳酸菌。     

2017-2021年上海市动物源粪肠球菌、屎肠球菌耐药性情况变迁分析

为了解上海地区动物源粪肠球菌、屎肠球菌对常见抗菌药物的耐药及其最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)变迁情况,采用微量肉汤稀释法对近五年采集的粪肠球菌、屎肠球菌进行10种常见抗菌药物敏感性测试。结果表明,458株粪肠球菌及283株屎肠球菌对头孢西丁、头孢噻呋及氧氟沙星耐药率较高(均高于60%),对青霉素、阿莫西林/克拉维酸及万古霉素的耐药率较低(均低于11%),粪肠球菌耐药率整体高于屎肠球菌,两者对氧氟沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、庆大霉素、利奈唑胺、恩诺沙星的耐药率存在较大差异(耐药率差异为15%～44%)。五年间,粪肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、氧氟沙星的MIC₅₀及MIC₉₀均呈下降趋势;屎肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、头孢西丁及氟苯尼考的MIC₅₀及MIC₉₀均呈下降趋势。研究表明,近年来上海地区动物源粪肠球菌、屎肠球菌的耐药情况有好转趋势,仍需继续加强肠球菌耐药性监测。     

Isolation，Identification and Antibiotics Resistance Analysis of Enterococcus from Yak

17 feces samples of yak which were collected in Hongyuan county were measured with Gram staining method and 16S rRNA molecular identification in this study.8 suspected Enterococcus were separate from feces samples by bacteria purification and PCR amplification with 1 500 bp specific band. 6Enterococcus faecalis and 2Enterococcus faecium were identified through 16S rRNA sequencing.The homology analysis of the strains revealed that the homology between Enterococcus faecalis and reference strains sequence were 99.7% to 100%,that of Enterococcus faecium and reference sequence were 98.2% to 99.2%,indicating that the yak Enterococcus was highly conserved in the process of genetic evolution.The drug sensitive test results showed that the isolated strains were highly resistance to aminoglycoside antibiotics.Enterococcus faecium 11-1-2 strain was not only 5 multi-resistant,but also showed resistence to vancomycin.Enterococcus faecalis strains was most 3 multi-resistant.The antibiotics resistance results revealed that the resistance of yak Enterococcus was serious and should be taken seriously.     

牦牛源肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

试验结合革兰氏染色及16S rRNA分子鉴定,对分离自红原县的17份牦牛粪便样中的肠球菌进行鉴定。结果显示,通过细菌分离纯化及PCR扩增,从牦牛粪便样品中分离出8株疑似肠球菌,分离菌的扩增产物经凝胶电泳后均产生1 500 bp特异性条带。16S rRNA测序结果显示,8株疑似肠球菌中,6株为粪肠球菌,2株为屎肠球菌。同源性比对分析显示,粪肠球菌与参考序列同源性为99.7%~100.0%,屎肠球菌与参考序列同源性为98.2%~99.2%,说明牦牛源肠球菌在遗传进化过程中高度保守。运用K-B纸片法进行药敏试验,结果显示,分离株对氨基糖苷类抗生素耐受性较高,2株屎肠球菌中,11-1-2菌株表现为5重耐药,且该菌株耐万古霉素,粪肠球菌主要表现为3重耐药,药敏结果提示牦牛源肠球菌耐药较严重,应引起高度重视。     

青贮料中肠球菌的分离与筛选

本试验从青贮料中分离肠球菌并对分离菌株进行初步鉴定与筛选,通过正交试验设计研究不同温度、初始pH和瘤胃液含量对3株分离菌生长的影响,筛选出适合作为奶牛饲用微生物的菌株。结果表明,3株分离菌的最佳培养条件相同为：培养基含葡萄糖2%、蛋白胨1%、瘤胃液20%、初始pH为5.8,接种量为3%,装液量为40 ml, 36℃培养24 h。 在该条件下,3株分离菌的生物量分别为1.9907、1.2963和1.2752。选择生物量最高的1号菌送中科院微生物所鉴定,结果为屎肠球菌。     

复合菌固态发酵棉籽粕工艺的初步研究

文章以枯草芽孢杆菌属、酵母菌属和乳酸菌属的6株菌为出发菌株,通过单因素试验和正交试验,确定了6株菌复合培养的最佳培养基配方为:糖蜜40 g/l、蛋白胨10 g/l、葡萄糖1 g/l、磷酸氢二钾0.5 g/l;并对复合菌固态发酵棉籽粕工艺条件进行了研究,确定了复合菌固态发酵棉籽粕的最适工艺条件为:料水比1:0.8,接种量为3%,发酵温度为30℃p,H值自然,发酵时间为48 h。在以上条件下,棉籽粕经过复合菌固态发酵后,物料的pH值降低到4.5以下,有益菌总数达到6.2×108 cfu/g,粗蛋白含量提高了1.76%,游离棉酚含量从618.52 mg/kg降低到274.16 mg/kg,降低了55.7%。