基因组Ⅰ型和Ⅴ型传染性胰脏坏死病毒的分离与鉴定

为调查造成中国西北某虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖场幼鱼出现持续性死亡的病因,采用组织病理切片观察及分子鉴定的方法对患病虹鳟进行了鲑鳟常见病毒筛查,同时采用系统发育分析、电镜观察、滴度测定及人工回归感染等方法对分离获得的毒株进行了基因型分析、显微结构观察及毒力特性分析等研究。结果表明:患病虹鳟的肝、脾及肾组织细胞发生广泛性坏死,并伴随空泡化及溶解等现象;由病鱼内脏组织制备的组织匀浆悬液均能够感染CHSE-214细胞并产生典型细胞病变(CPE);从该养殖场的不同养殖区域共分离到3株传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV),其中IPNV-F1和IPNV-W2属于基因组Ⅰ型,分别与IPNV中国分离株WZ2016(KX355401)和ChRtm213(KX234591)同源性最高,VP2基因片段序列一致性分别为100%和98.5%,IPNV-W1属于基因组Ⅴ型,与意大利毒株IPNV/O.mykiss/I/PN/208/Mar88(MG543567)同源性最高,二者的VP2基因片段序列一致性为99.1%;接种病毒后的CHSE-214细胞内存在大量呈晶格状排列的无囊膜病毒粒子,3株IPNV分离株在CHSE-214细胞上的平均滴度分别为10^(7.43) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-F1)、10(7.43) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-F1)、10^(7.30) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-W1)和10(7.30) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-W1)和10^(7.29) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-W2);分别以0.1 mL/尾的剂量向健康虹鳟幼鱼腹腔注射各IPNV分离株,在攻毒后60 d内虹鳟未出现死亡,攻毒后30 d时,病毒在组织中的平均滴度分别为10(7.29) TCID_(50)/0.1 mL(IPNV-W2);分别以0.1 mL/尾的剂量向健康虹鳟幼鱼腹腔注射各IPNV分离株,在攻毒后60 d内虹鳟未出现死亡,攻毒后30 d时,病毒在组织中的平均滴度分别为10^(4.50) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-F1)、10(4.50) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-F1)、10^(5.38) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W1)和10(5.38) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W1)和10^(4.13) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W2),攻毒后60 d时,病毒在组织中的平均滴度下降为10(4.13) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W2),攻毒后60 d时,病毒在组织中的平均滴度下降为10^(3.43) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-F1)、10(3.43) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-F1)、10^(4.50) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W1)和10(4.50) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W1)和10^(3.21) TCID_(50)/0.1 g组织(IPNV-W2)。研究表明,该发病养殖场同时存在基因组Ⅰ型和Ⅴ型的IPNV,本研究首次从同一养殖场分离到两种基因型的IPNV,可为中国传染性胰脏坏死病(IPN)的防控提供参考。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10^(5.2)、10(5.2)、10^(3.2)、10(3.2)、10^(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10~(5.2)、10~(3.2)、10~(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

虹鳟传染性胰脏坏死性状全基因组关联分析

为了探究虹鳟传染性胰脏坏死症(Infectious Pancreatic Necrosis, IPN)抗性的遗传基础,本文采用三种二歧性状的分析方法,对来自58个全同胞家族的749尾虹鳟（271尾抗性和478尾易感）,注射传染性胰脏坏死病毒后的存活情况进行全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)。关联分析结果表明,共鉴定到两个QTN与虹鳟IPN抗性显著关联,位于四号染色体和对应的Scaffold上。以这些检测到的QTNs作为探针,对比虹鳟全基因组信息,筛选得到四个候选基因,它们可能是影响虹鳟IPN抗性的重要功能基因。通过对比三种方法的检测结果,得知GRAMMAR-Lambda法对检测二歧性状QTNs的统计能力略高于SAIGE和GMMAT法,具有更好的统计性能。这些研究结果为虹鳟抗传染性胰脏坏死病毒的遗传选育提供了分子标记,为虹鳟抗传染性胰脏坏死病毒的研究提供了理论基础。     

传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用

为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreas necrosis virus, IPNV)的检测方法,以GenogroupⅠ型的IPNV ChRtm213分离株基因组RNA为模板,利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNV VP3基因序列(711 bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta进行VP3蛋白表达,以纯化的VP3蛋白为免疫原制备鼠抗血清,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)对抗血清效价进行测定,并利用间接免疫荧光抗体法(indirect immunofluorescent antibody test, IFAT)和中国不同地区的IPNV分离株,对抗血清识别中国现行IPNV分离株的能力进行免疫学鉴定。结果表明:SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP3蛋白条带单一,相对分子质量约为45 000,与理论值相符;抗血清效价分析显示,所制备的鼠抗IPNV VP3血清与IPNV的反应效价为16 000,与纯化的IPNV VP3蛋白的反应效价为32 000;间接免疫荧光抗体法分析显示,制备的鼠抗血清能够特异性识别中国不同地区的GenogroupⅠ和GenogroupⅤIPNV分离株,且该血清不与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)发生交叉反应,具备较好的特异性。研究表明,本研究中利用原核表达系统表达的IPNV VP3蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IPNV VP3抗血清能够特异性识别中国不同地区的IPNV分离株。     

传染性胰脏坏死病毒VP3抗血清的制备及应用

为丰富传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreas necrosis virus,IPNV)的检测方法,以GenogroupⅠ型的IPNV ChRtm213分离株基因组RNA为模板,利用一步法RT-PCR扩增获得了编码IPNV VP3基因序列(711 bp),将其克隆至pET-32a原核表达载体,利用大肠...     

传染性胰脏坏死病酵母展示疫苗的免疫效果评价

为了评价前期构建的传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)VP2蛋白酵母展示疫苗(EBY100/pYD1-VP2)的免疫保护效果,以虹鳟Oncorhynchus mykiss为试验动物分析了口服免疫的保护效力,利用流式细胞仪和细胞免疫荧光检测方法确定疫苗株的最佳诱导时间为60 h,然后大量制备酵母口服疫苗,分别利用单次和多次口灌的方式对虹鳟进行免疫;单次免疫为连续免疫7 d,多次免疫为单次免疫一周后再以相同剂量免疫7 d,免疫剂量均为每天100μL疫苗菌(1×10⁽¹⁰⁾ CFU/mL),同时设置空载体酵母菌免疫组和PBS模拟免疫组,通过免疫相关基因定量、中和抗体滴定及攻毒后IPNV病毒载量分析口服疫苗的保护效果。结果表明:疫苗株免疫组虹鳟头肾、后肠中的免疫相关基因IgM、IgT、CD4、CD8在各时间点的表达量均显著高于空载体酵母菌免疫组和PBS模拟免疫组(P<0.05),且与单次免疫组相比,多次免疫组免疫相关基因表达量显著升高(P<0.05);在疫苗株免疫组虹鳟血清中均发现了中和抗体,其中,多次免疫组各时间点血清中和抗体效价均高于单次免疫组,免疫后第49天时IPNV中和抗体效价达到最高(39.28);病毒载量分析显示,各时间点疫苗株免疫组VP1和VP2基因表达量显著低于空载体酵母免疫组(P<0.05),并且在第14天、第21天时,疫苗株单次免疫组VP1和VP2基因表达量分别为疫苗株多次免疫组基因表达量的2.25、3.33倍(VP1)和2.67、2.80倍(VP2)。研究表明,该口服疫苗可诱导虹鳟产生非特异性和特异性免疫应答,对虹鳟具有显著的免疫保护作用。     

传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立

为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。     

传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白酵母表面展示系统的建立

为了将传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virous,IPNV)的主要保护性抗原及IPNV检测和疫苗开发的主要靶基因——VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究中基于IPNV VP2基因序列设计引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化至酵母EBY100感受态细胞中,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100/pYD1-VP2,再向EBY100/pYD1-VP2中加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,并采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。结果表明:经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析显示,重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内荧光强度与诱导时间成正相关,诱导24、36、48 h组及对照组(48 h)各组之间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)。研究表明,IPNV VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面,本研究结果可为IPNV口服活载体疫苗的研制奠定基础。     

鸡肾型传染性支气管炎病变毒株的分离和鉴定

从疑似肾型传染性支气管炎(IB)死鸡肾脏中分离到1株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第8代,卷缩胚达到50%。第3~8代的尿囊液经胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集。以琼脂凝胶沉淀试验检测,病料处理后的收获液、第3~8代鸡胚尿囊液与肾型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和肾型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合。该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对新城疫病毒LaSota株的增殖有显著干扰作用。动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达40%,死鸡的病理变化明显而典型。结果表明,该分离毒株是鸡肾型IBV。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SG株的分离鉴定及全基因组序列测定与分析

自山东寿光地区疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织中分离到一株鸭肝炎病毒,命名为SG株DHV-Ⅰ.该病毒能被DHV-Ⅰ标准抗血清中和,该病毒第5代病毒尿囊液对12日龄鸭胚的ELD50为10-5.58/0.2 mL,对7日龄雏鸭的LD50为10-4.68/0.2 mL.全基因组序列比较分析发现,SG株DHV-Ⅰ基因组结构为5' UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3' UTR,与A型DHV-Ⅰ毒株的核苷酸同源性为94.9%～99.7%,氨基酸同源性为94.5%～99.7%,表明SG株DHV为一株A型DHV-Ⅰ强毒.     

鸡肾型传染性支气管炎的分离鉴定与免疫研究

从吉林省３个地区接种过传染性支气管炎痉苗后又发生肾型传染性支气管炎的鸡尸中采集了８份病料,经抗菌处理后接种鸡胚尿囊腔中进行病毒的分离与扩繁。并通过鸡胚发育观察、ＨＡ试验、干扰ＮＤＶ试验,耐酸碱试验及电镜观察,证明其中２株是ＩＢＶ。又对分离株（ＪＮ５、ＪＮ６）进行了琼脂扩散试验、回归试验及ＥＩＤ５０测定。经上述试验后,采用标准了Ｔ株与ＪＮ６株病毒等量混合制成佐剂灭活疫苗。该苗免疫试验鸡后,气管注射攻     

国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析

用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。     

传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

利用RTG-2细胞对传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR-Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786 bp的基因纯化、克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。结果表明:此病毒的核酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.3%和93.6%;翻译出的氨基酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.1%和93.5%。系统进化树分析结果表明,此毒株与中国近期公布的毒株zyx有密切的亲缘关系。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定

从浙江省内大型商品代鸡场和专业户鸡场出现的以肾肿大为主要特征的呼吸道疾病鸡中分离到六株病毒,易感雏鸡。接种３ｄ出现一过性呼吸道症状,感染鸡死亡集中在感染后１４－１８ｄ,病死鸡出现肾肿大,苍白花斑状,大量尿酸盐沉积。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定与免疫研究

从吉林省３个地区接种过传染性支气管炎疫苗（Ｈ１２０、Ｈ５２）后又发生肾型传染性支气管炎的鸡尸中采集了８份病料,经抗菌处理后接种鸡胚尿囊腔中进行病毒的分离与扩繁。并通过鸡胚发育观察、ＨＡ试验、干扰ＮＤＶ试验、耐酸碱试验及电镜观察,证明其中２株是ＩＢＶ。又对分离株（ＪＮ５、ＪＮ６）进行了琼脂扩散试验、回归试验及ＥＩＤ５０测定。经上述试验后,采用标准Ｔ株与ＪＮ６株病毒等量混合液制成油佐剂灭活疫苗。该苗免疫试验鸡后,气管注射攻毒法保护指数（ＰＩ）为０９３１,滴鼻攻毒法保护指数（ＰＩ）为０９６３。免疫接种４５万只鸡,免疫期为６个月,保护率达９８％以上。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离鉴定与免疫试验

从两个鸡场采集具有肾型染性支气管炎特征的产现鸡病料，在鸡胚盲传４代分离到Ｈ和Ｚ两株病毒。在两毒株，在鸡胚传代可致胚死亡妆出现典型侏儒胚，能极显地干扰鸡新城疫病毒在鸡胚上增殖。     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

利用RTG～2细胞对传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR—Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786bp的基因纯化、克隆至pMD18－T载体中进行序列测定,并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。结果表明：此病毒的核酸序列与标准毒株RB－1、代表毒株WRAC的同源性分别为96．3％和93．6％;翻译出的氨基酸序列与标准毒株RB－1、代表毒株WRAC的同源性分别为96．1％和93．5％。系统进化树分析结果表明,此毒株与中国近期公布的毒株zyx有密切的亲缘关系。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定与防治

[目的]对新疆疑似肾型传染性支气管炎发病鸡病料进行病毒分离和鉴定.[方法]采用3种不同的治疗方案对发病鸡群进行治疗.[结果]经过处理的病料组织在SPF鸡胚上盲传至第3～4代后,鸡胚出现尿囊绒毛膜增厚,鸡胚卷缩变小、侏儒胚等鸡传染性支气管炎的特征性病变.将收获的病毒液进行电镜观察、病毒中和试验、病毒干扰试验、动物回归试验等证实,分离的3株病毒均属于鸡肾型传染性支气管炎病毒.[结论]电解多维+肾肿散(中药)+阿莫西林组合的治疗效果最好,治愈率达到80;～90;.