鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.     

鳗鲡疱疹病毒ORF87基因克隆及其多克隆抗体的制备

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus,AngHV） ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株（NC_013668）的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至pET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源（相似性为99.72%）,仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点（pI）为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族（PKC-like Superfamily）的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1:16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】 AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。     

鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

含CpG序列PRRSV ORF5重组质粒在小鼠细胞中的免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,将成功构建含CpG序列PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1- ORF5免疫SPF小鼠,检测小鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明,构建的含CpG序列真核重组表达质粒CpG-pVAX1- ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫.     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较（英文）

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区序列分析

白斑综合征已给安徽省克氏原螯虾产业带来了巨大的经济损失。为了解安徽省白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)分子流行病学,2016年4—8月在安徽省6个市采集9个养殖的克氏原螯虾样本进行WSSV套式PCR检测,扩增病毒可变区ORF94、ORF75和ORF125,将获得序列进行比较分析。结果显示,9个样本均在第1轮PCR扩增中获得阳性结果,其ORF94的重复单元(repeat unit,RU)数量为2、4、7、8和12,2RUs为常见基因型,ORF75的组合RUs总数为3、6、9、10和11,9 RUs为常见基因型,排列顺序为45、102、45、102、3×45、102和45,ORF125的RUs为5~9,其中7 RUs和6 RUs为常见基因型。     

猪TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遗传变异分析及其真核表达研究

【目的】研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。【结果】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%~100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%~99.7%。Western blot结果表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。【结论】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。     

猪Ⅱ型圆环病毒江苏株全基因进化及ORF3蛋白的生物信息学分析

对NCBI已经登记的国内分离的PCV2江苏株(GQ358994.1)进行序列比对及进化分析,并对其ORF3编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测和推断。结果表明,PCV2江苏株与国内分离株序列同源性极高(>99%),ORF3蛋白无跨膜区域,二级结构中自由卷曲含量最高,为54.81%,不含有糖基化位点,但有8个磷酸化位点。综合分析得出,ORF3蛋白具有大量的抗原决定簇。通过对ORF3蛋白进行生物信息学方法分析,为PRRSV疫苗设计提供理论基础。     

柞蚕真菌蛋白酶抑制剂基因CP8的克隆与表达分析

蛋白酶抑制剂在昆虫免疫中发挥着重要的作用。首次克隆获得了一个柞蚕真菌蛋白酶抑制剂基因ApCP8的开放阅读框(ORF)序列。该基因的ORF序列全长318 bp,编码了一个由106个氨基酸组成的蛋白(包括19个氨基酸的信号肽)。预测蛋白的等电点和分子量大小分别为9.05和11.3 kD。序列分析和进化树构建结果表明,ApCP8与已知的几种昆虫相应蛋白具有很高的同源性,且与印度柞蚕的CP8聚在同一进化分支上。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果表明,ApCP8主要在柞蚕脂肪体中高表达;且ApCP8在被白僵菌诱导的初期高表达,推测其可能参与了柞蚕抗真菌的免疫反应。同时,利用pET-32a(+)载体对ApCP8进行了原核表达,并对重组表达蛋白进行了纯化和抗体制备。本研究将为进一步探索ApCP8的抗真菌功能奠定前期基础。