獭兔肠黏膜乳杆菌的分离鉴定及其体外益生特性研究

【目的】分离筛选适于在獭兔肠道中存活并定殖的高黏附性乳酸菌株。【方法】通过乳酸菌选择性培养基从5和10日龄哺乳獭兔肠黏膜中分离具有抑制大肠杆菌活性的菌株,经16SrRNA基因序列分析进行鉴定,并检测其耐人工胃液、耐胆盐及黏附特性、表面疏水性等益生特性。【结果】分离筛选出3株具有较强抑制大肠杆菌活性的菌株,分别鉴定为短乳杆菌(L1)、植物乳杆菌(L2)、干酪乳杆菌(L3),其抑菌活性大小为L3L2L1。3株菌株均能耐受pH=4.0的人工胃液;在pH=3.0人工胃液中,L2和L3的活菌含量未出现明显变化(P0.05),而L1的活菌含量显著下降(P0.05);3株菌株在pH=2.0和pH=1.8人工胃液中的活菌含量均显著降低(P0.01)。L1和L2均能耐受2.0g/L胆盐;虽然L1和L2在3.0g/L胆盐中的活菌量出现极显著(P0.01)和显著(P0.05)下降,但二者仍保留较高活菌含量;胆盐对L3的存活有明显抑制作用,随着胆盐含量的升高,L3的活菌含量极显著降低(P0.01)。L2和L3对黏蛋白的黏附率无显著差异(P0.05),均显著高于L1(P0.05)。L3的表面疏水性最高,L2次之,二者之间无显著差异(P0.05);L1的表面疏水性低于L2(P=0.092),显著低于L3(P0.05)。【结论】分离所获得的3株乳杆菌均具备益生菌特性,其中以植物乳杆菌L2最佳。     

枯草芽孢杆菌拮抗病原菌黏附和入侵Caco-2细胞的研究

为探讨枯草芽孢杆菌及其培养上清液对产肠毒素大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗黏附作用,本试验将产肠毒素大肠杆菌K88或鼠伤寒沙门氏菌SL1344与枯草芽孢杆菌及其培养上清液先后加到Caco-2细胞上,用活菌计数的方法观察产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌黏附Caco-2细胞的情况。结果显示:在排斥、竞争和置换试验中,枯草芽孢杆菌菌体均能够明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344的内化,在竞争试验时K88的黏附减少了71.2%、SL1344的黏附及内化减少了92.9%,但枯草芽孢杆菌的培养上清液只有在竞争试验中才能明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344内化。提示:枯草芽孢杆菌通过与病原菌竞争黏附位点来抑制病原菌对Caco-2细胞的黏附和入侵。     

基于永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02对猪源益生性乳酸菌的筛选

【目的】从健康仔猪的粪便及各肠段内容物和黏液中分离乳酸菌,并以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外细胞模型对猪源益生性乳酸菌进行筛选。【方法】采用分离培养和常规生化试验对乳酸菌进行分离与鉴定。用永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02作为体外模型,通过黏附性试验、耐酸耐胆盐试验和对致病菌的黏附抑制试验对菌株进行筛选。【结果】分离筛选出了12株乳酸菌,其黏附能力存在差异。Y091231、Y091221、Y224031、X302032、Y223052和Y223072等6株菌的黏附性较好,黏附指数依次为:2 903.25±83.33,2 320.37±81.02,1 965.43±37.72,1 416.12±62.74,1 100.00±68.10,988.73±17.06。对其进行耐酸耐胆盐试验和抑菌试验,结果表明,菌株Y091231、Y091221和Y224031对致病菌均具有较强的黏附抑制能力,且对高胆盐、低pH具有较强的耐受性。其中Y091231对大肠杆菌C83921的黏附抑制率可达(99.40±3.17)%,Y091221对致病性沙门氏菌的黏附抑制率为(97.10±2.04)%,Y091231对金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制率为(98.00±2.31)%。Y091231、Y091221和Y224031 3株菌分别被鉴定为发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌。【结论】筛选得到的3株益生性乳酸菌,不仅具有耐酸耐胆盐能力,而且对小肠黏膜上皮细胞具有强黏附性,对大肠杆菌C83921、致病性沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CVCC2258具有较强的黏附抑制能力,可作为肠道微生态制剂的候选菌株。     

植物乳杆菌C88对H2O2诱导氧化损伤的 Caco-2细胞的保护作用

【目的】文章旨在研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）C88的抗氧化作用。【方法】采用0.1 mmol•L-1 和0.2 mmol•L-1浓度H2O2连续处理Caco-2细胞12—48 h造成氧化损伤,通过测定细胞培养液上清和细胞裂解液的自由基清除能力及抗氧化物酶活性,评价植物乳杆菌C88对Caco-2细胞抗氧化损伤的保护作用。【结果】与氧化损伤模型组相比,植物乳杆菌C88在1011CFU/mL浓度下,能显著提高细胞裂解液的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性(P＜0.05)和总抗氧化（T-AOC）能力(P＜0.05);以及细胞裂解液的羟自由基清除率(P＜0.05)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）(P＜0.05)和超氧化歧化酶（SOD）活性。细胞裂解液的羟自由基清除率低于氧化应激对照组。【结论】植物乳杆菌（L. plantarum）C88通过提高Caco-2细胞的自由基清除能力和抗氧化酶活性,表现出了较强的抗氧化活性。     

乳杆菌竞争性抑制两种病原菌粘附上皮细胞的研究

【目的】研究嗜酸乳杆菌(LAB1)在体外模拟预防和治疗条件下,竞争性抑制致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli )和沙门氏菌(Salmonella choleraesuis,S.cho)对仔猪空肠上皮细胞系（IPEC-J2）的粘附作用。【方法】 用LAB1预处理IPEC-J2后再用E. coli或S.cho攻毒为模拟预防实验;用E. coli或S.cho先攻毒IPEC-J2后再用LAB1处理为模拟治疗试验。提取粘附后的3种菌及IPEC-J2的DNA,使用文献记载和自行设计的引物,利用实时荧光定量PCR方法,量化检测LAB1与E. coli 、S.cho之间的竞争性粘附率。【结果】在模拟治疗试验中,在高（1.0×109 CFU）、中（1.0×108CFU）、低（1.0×107CFU）3种浓度的LAB1处理条件下,能显著抑制高、中浓度S.cho对IPEC-J2的粘附（P＜0.05）;在模拟预防试验中,相同浓度的LAB1能显著抑制相同浓度的S.cho对IPEC-J2的粘附（P＜0.05）。在模拟预防和治疗试验中,3种浓度LAB1均能显著抑制低浓度E. coli对IPEC-J2的粘附（P＜0.05）,高浓度LAB1能显著抑制高、中浓度E. coli对IPEC-J2的粘附（P＜0.05）。【结论】在体外试验条件下,LAB1对E. coli及S.cho粘附IPEC-J2有竞争性抑制作用。在模拟预防和治疗试验中,LAB1对E. coli及S.cho粘附IPEC-J2的竞争性抑制作用效果有所不同。     

散养茶花鸡源乳酸菌分离鉴定及益生特性研究

【目的】从国家级畜禽资源保护品种茶花鸡中分离乳酸菌,研究其益生特性,以期为禽用益生菌制剂研发奠定基础。【方法】采集散养茶花鸡新鲜粪便,使用MRS培养基分离乳酸菌,采用生理生化试验和16S r DNA基因序列分析法鉴定,并研究其胃肠道耐受性、抑菌活性、抗生素敏感性和肠上皮细胞黏附能力等益生特性。【结果】分离得到CHF4-1、CHF6-2、CHF7-2和CHF10-2共4株菌株。生理生化鉴定和16S rDNA序列分析结果表明:CHF4-1、CHF6-2、CHF7-2和CHF10-2分别为唾液乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌;与参考菌株鼠李糖乳杆菌GG相比,CHF6-2和CHF10-2具有较强的胃肠道耐受性和抗菌活性;加氏乳杆菌CHF6-2除对头孢噻肟中度敏感之外,对其余9种抗生素均敏感,且其细胞黏附水平为(13.07±0.22)个/细胞,黏附能力最强。【结论】从散养茶花鸡粪便中分离得到唾液乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌4株乳酸菌,其中加氏乳杆菌CHF6-2具有显著胃肠道耐受性、抑菌活性、抗生素敏感性和肠上皮细胞黏附能力等益生特性,可作为微生态制剂候选菌株进一步开展深层次研究。     

虾青素对脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响

【目的】研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)通过TLR4/My D88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响。【方法】采用MTT法确定虾青素和LPS对IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞的最佳处理浓度和处理时间,在处理后采用实时荧光定量PCR检测IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞炎症因子NF-κB、TNF-α、IL-6和IL~(-1)β的m RNA相对表达量,采用ELISA检测上述炎症因子的分泌量。【结果】当处理3 h,虾青素浓度达到150μmol·L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值;当处理6 h,LPS质量浓度达到100 ng·m L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值。与对照组相比,LPS组IPEC-J2细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β的m RNA相对表达量和分泌量显著升高(P0.05);与LPS组相比,AST+LPS组NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β在IPEC-J2细胞中的m RNA相对表达量和分泌量显著降低(P0.05),而在转染IPEC-J2细胞中的炎症因子m RNA相对表达量和分泌量均无显著变化(P0.05)。【结论】虾青素可以抑制细胞炎症反应,且对细胞的保护作用与TLR4/My D88/NF-κB信号通路相关。     

魔芋飞粉生物碱的抑菌活性及抑菌机理研究

【目的】探究魔芋飞粉生物碱(Alkaloid from konjac powder,AKP)的抑菌作用及其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理,为新型天然抑菌剂和防腐剂的开发提供理论依据。【方法】采用液体倍比稀释法,确定AKP对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌4株供试菌的最小抑菌质量浓度(Minimum inhibitoryconcentration,MIC),并采用牛津杯法测定AKP对上述4株供试菌的抑菌圈大小;通过测定在AKP作用下,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线、菌体培养液电导率及观察细胞膜完整性、细胞形态等,对AKP的抑菌作用及其机理进行分析。【结果】AKP对4株供试菌均有明显的抑制作用,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强(MIC为10mg/mL),大肠杆菌次之(MIC为20mg/mL)。AKP对供试菌的抑菌圈直径依次为金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌鼠伤寒沙门氏菌。菌体生长曲线显示,AKP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制效果。AKP作用后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜受损,存活率显著降低,菌体培养液电导率显著上升。电镜观察发现,AKP使菌体细胞膜出现破损,部分菌体出现空腔。【结论】AKP具有抑菌作用,其可能通过破坏细菌细胞膜结构而导致内容物外泄,进而影响细胞的生长代谢或造成细胞死亡,从而抑制其生长。     

植物乳杆菌R23耐受二氧化硫胁迫的应激机制

【目的】考察植物乳杆菌R23抗氧化酶与膜磷脂脂肪酸等在菌体应答二氧化硫胁迫中的作用机制。【方法】以植物乳杆菌R23为试验菌并对其进行梯度二氧化硫胁迫处理,借助扫描电子显微镜观察菌体超微形态,采用酶联免疫法与考马斯亮蓝法检测抗氧化酶活力及丙二醛含量,通过MIDI系统分析细胞膜磷脂脂肪酸结构。【结果】二氧化硫胁迫激发了植物乳杆菌R23胞内抗氧化酶(尤其是过氧化氢酶CAT)活力的显著提升,80mg·L^-1二氧化硫胁迫下超氧化物歧化酶SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶GPX活力分别是对照处理的1.64、2.14、1.62倍,进而维持了丙二醛MDA较低的增长幅度和基本正常的菌体形态;然而过高二氧化硫(120 mg·L^-1)胁迫后,抗氧化酶活力趋于下降,膜脂质过氧化反应加剧,部分菌体细胞表面出现明显皱缩。细胞膜磷脂脂肪酸分析发现,二氧化硫胁迫促使植物乳杆菌R23中饱和、直链、长链和环丙烷脂肪酸总量发生不同程度提升,其中总直链脂肪酸高达52%,且与支链脂肪酸比例从7.15显著提升至9.72。【结论】植物乳杆菌R23通过提高抗氧化酶活力或增加饱和、直链、长链...     

响应面法优化植物乳杆菌V02冻干保护剂研究

【目的】利用单因素结合响应面的研究方法,旨在使用真空冷冻干燥技术得到植物乳杆菌V02直投式乳酸菌发酵剂菌粉。【方法】以植物乳杆菌V02为试验菌种,冻干存活率为衡量指标,通过单因素试验结合Box-Behnken响应面法对不同保护剂的种类及质量分数进行筛选和复配,得到优化后的复配保护剂质量分数配比,最后进行验证试验。【结果】当选用质量分数分别为12.23%的脱脂乳粉,9.00%的麦芽糊精和6.50%的D-海藻糖时,复配保护剂对植物乳杆菌V02的冻干保护率可达到99.88%,相比空白组的冻干存活率提高了90.51%。【结论】经响应面优化后的植物乳杆菌V02保护剂配方可有效保护菌体在真空冷冻干燥过程中的菌体存活,此配方对于植物乳杆菌V02有较好的保护效果。