烟草扭脉病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

烟草丛顶病是近年来在云南省西部的保山、大理等各大烟区频繁爆发流行的一类新的烟草病害。Ｍｏ等认为云南发生的这类病害与津巴布韦发生的由幽影病毒属 (Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)的烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａｃ ｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ,ＴＢＴＶ)引起的烟草丛顶病是同一种病。ＳＭＩＴＨ等认为烟草丛顶病由两种病毒———ＴＢＴＶ及黄症病毒科 (Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ)的烟草扭脉病毒(ｔｏｂａｃｃｏｖｅｉｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇｖｉｒｕｓ,ＴＶＤＶ)复合侵染引起。自然界幽影病毒属病毒主要依赖黄症病毒科病毒作为辅助病毒进行蚜…     

马铃薯X病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是重要的马铃薯病毒之一,几乎分布于全国所有马铃薯种植区域,严重影响马铃薯的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的PVX的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了PVX黑龙江分离物(P2)全长CP基因序列。序列分析表明:P2CP基因全长711 bp,编码237个氨基酸残基,与GenBank中17个不同分离物的CP核苷酸序列同源性为75.5%~96.3%,氨基酸序列同源性为89.4%~99.2%。依据PVXCP氨基酸序列建立系统进化树,将PVX不同分离物划分为两大类群,P2与PVX中国分离物亲缘关系较近,同属于类型Ⅱ,表现一定的地域相关性。同时,应用该RT-PCR分子检测体系进行马铃薯样品检测。     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

番茄褪绿病毒郑州分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

近年来郑州番茄产区发现疑似番茄褪绿病毒(To CV)侵染引起的叶脉间褪绿症状,为了确定病原种类,采集典型症状的叶片,提取RNA,根据已知的To CV基因组序列设计特异性引物To CVCPF/To CVCPR,采用RT-PCR方法对样品进行检测,扩增得到约750 bp大小的目的条带,对获得的特异性片段回收、克隆、测序后进行序列同源性及系统进化分析。结果显示,郑州病样的病毒分离物外壳蛋白基因由774 bp组成,其核苷酸和氨基酸序列与To CV其他分离物同源性均在96%以上;进化分析表明,郑州分离物与河北、天津分离物亲缘关系最近。造成郑州番茄产区褪绿症状的病原为To CV。     

马铃薯Y病毒黑龙江分离株外壳蛋白基因克隆及序列分析

为研究马铃薯Y病毒的检测方法,参考GenBank中马铃薯Y病毒的全基因序列,应用Primer 6.0引物软件设计并合成了一对特异性引物PVYF、PVYR,利用RT-PCR方法对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行特异性扩增,对扩增片段进行序列测定并进行序列比对。结果表明:引物PVYF、PVYR可以扩增出包含PVY病毒CP基因全长的cDNA特异性片段,序列分析结果表明PVY病毒黑龙江分离株CP基因与GenBank上的40个不同PVY病毒分离株的CP基因氨基酸序列同源性为92.1%~97.4%,说明PVY病毒CP基因保守性较高,可以用作制备PVY病毒血清型检测方法的抗体基因。     

马铃薯卷叶病毒分离株外壳蛋白基因和17k蛋白基因的克隆及序列分析

从典型的马铃薯卷叶病毒病株中直接提出植物总RNA，根据PLRV外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，经RT－PCR法扩增出全长的cDNA片段，将其克隆到质粒pGEM-3Zf( )上，并进行了序列分析。结果表明，克隆的cDNA片段由627个核苷酸组成，编码208个氨基酸组成的理论分子量为23k的蛋白，与PLRV外壳蛋白的大小一致；此外克隆片段还含有一个不同于外壳蛋白基因的阅读框架，该框架由465个核苷酸组成，编码155个氨基酸组成的理论分子量为17k的蛋白，与PLRV的17k蛋白大小一致，与国外报道的几个株系相比，PLRV分离和的外壳蛋白基因及17k蛋白基因的核苷酸同源率分别高达97.5%-99.7%和96.5%-99.6%，由此推测的氨基酸同源率高达97.6%－99.5%和96.1%-99.4%，说明所克隆的PLRV外壳蛋白基因和17k蛋白基因具有高度的保守性，本研究克隆了PLRV分离物外壳蛋白和17k蛋白基因的序列，为进一步进行抗PLRV基因工程研究奠定基础。     

黄瓜花叶病毒强毒株外壳蛋白基因克隆和序列分析

在辣椒上分离到一株黄瓜花叶病毒分离物CP310，对其进行14种寄主植物生物学反应测定，发现CP310在心叶烟、克里夫兰烟等植物上表现致死症状，在番茄、烟草表现为植株明显矮化。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物，采用常规RT-PCR方法对其外壳蛋白基因进行扩增并克隆，序列分析结果显示：该分离物外壳蛋白基因全长657个核苷酸，编码218个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与所比较的CMV亚组I的分离物有很高的同源性，分别为91．0％～94．7％和96．0％～98．2％．与CMV亚组Ⅱ的同源性分别仅为76．6％～78．0％和76．0％～78．9％。     

口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析

应用RT PCR和nPCR实现了口蹄疫病毒O/PanAsia/10株的全衣壳基因的克隆和序列测定.对核苷酸和氨基酸的序列分析表明,与经典O型毒株比较存在较大变异.其中4种结构蛋白的变异顺序是VP1>VP3>VP2>VP4.P1基因G+C值约55%.全衣壳蛋白相对分子质量约8 0×104.主要结构蛋白VP1呈碱性,等电点约9 5.     

水稻条纹病毒外壳白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白（CP）的病害特异性蛋白（SP）是两种与症状密切相关的蛋白，本文对我国云南YL分离物的CP基因和SP基因进行了克隆和测序，结果表明，CP基因和SP基因分别由966和534个核苷酸组成，与已发表的一些分离物相比，LY分离物CP基因与我国山东C分离物和日本T，M分离物的核苷酸序列一致性在96．0％左右，氨基酸序列一致性为97．0％，但从序列一致性和碱基变异方式来看，C分离物与T，M分离物的亲缘关系稍近，YL分离物SP基因和云南CX分离物之间有99．0％的核苷酸序列一致性，但与T，M分离物的核苷酸一致性只有94．0％左右，可见，不同分离物间SP基因的变异与基地理分布有密切的关系。     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

黄瓜花叶病毒丹参株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从河北安国具有典型花叶症状的大田丹参叶片中分离到病毒病原 ,经过生物学接种、电镜观察和酶联免疫吸附测定表明该离物与CMV有较近的亲缘关系 (记为CMV DS)。从叶片中提取了该病毒的总RNA ,按照CMV外壳蛋白 (CP)基因前后保守区序列 ,设计合成了 1对特异引物 ,采用RT PCR法扩增了 780bp的全长CP基因的cDNA序列 ,将其克隆到pGEM T载体上 ,并进行序列分析。结果重组克隆序列长为 778bp ,含 1个开放阅读框架 (ORF) ,长度为 65 7nt,编码 2 1 8个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较 ,CMV DS和亚组Ⅰ株系的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性为 93 3%～ 99 4%和95 9%～ 1 0 0 % ;而与亚组Ⅱ株系的核苷酸和氨基酸序列同源性仅为为 78 4%～ 79 0 %和81 2 %～ 83 0 % ,表明CMV DS与CMV亚组Ⅰ的株系较亚组Ⅱ株系同源关系更密切 ,将其划归为CMV亚组IB中 ,这是首次在丹参上发现的CMV株系。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆与系统进化分析

从贵州威宁等地采集马铃薯病叶样本,采用试管捕捉反转录PCR（tube-capture-RT-PCR,TC-RT-PCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因,编码237个氨基酸残基.系统进化分析表明,PVX CP基因可分为两大类群,推测分离物属于X3株系,并建议重型花叶也可作为PVX病叶样本.     

辽宁省玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因序列分析及株系鉴定

对辽宁地区近年发生的玉米矮花叶病毒株系进行了鉴定.电镜下病毒粒子形态呈线条状,大小为(420～750)nm×(13～15)nm,超薄切片中有风轮状内含体.以病毒RNA为模板,按已知的玉米矮花叶病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列合成引物,逆转录合成cDNA,以此为模板进行PCR,扩增出了1kb左右的CP基因片段,将这一片段插入到载体pUC19中转化E.coliDH5a菌株,得到了CP基因克隆.cDNA序列分析表明,和中国已报道的玉米矮花叶病毒B株系(MDMV-B)外壳蛋白基因序列同源率达98.4%,氨基酸序列同源率99.4%.由此认为引起辽宁地区玉米矮花叶病的毒原为MDMV,其流行株系为B系.     

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 从山东省3地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒6个分离物，将其分别命名为TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5和TuMV-SD6。利用RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因，测定了它们的核苷酸序列，并进行了序列分析。结果表明，6个分离物的CP基因均为867个碱基，核苷酸序列同源性较高, 达97.0%～99.4%；它们与World-B组分离物的同源性最高，达91.8%～100%；与Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之，在89.1%～91.0%之间；与basal-B组分离物的同源性最低，仅86.0%～90.3%。基于TuMV的CP基因核苷酸序列的分子进化树显示，TuMV分离物可分为4组，本研究所分离到的6个TuMV山东分离物属于第四组，即world-B组。用分离到的6个TuMV分离物对已获得的转TuMV CP基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明，尽管作为转基因的CP基因与这6个分离物的CP基因只有88.2%～88.9%的同源性，但转基因大白菜对这6个分离物均具有明显抗性。     

鸡传染性喉气管炎病毒长葛株gE全基因的克隆与序列分析

[目的]防治鸡传染性喉气管炎,减少该病对养鸡业造成的损失。[方法]参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因序列设计并合成1对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1 550 bp的特异性条带,并克隆至pGEM-T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gE基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定。[结果]与GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因和其他部分疱疹病毒gE基因序列进行比较,发现传染性喉气管炎病毒间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.9%、99.8%;与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性分别为25.6%、23.9%、28.3%、26.1%。[结论]不同ILTV毒株之间gE基因差异甚小,gE基因比较保守,但与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性较低。该研究为gE基因的功能研究提供了依据。     

水貂株犬瘟热病毒融合蛋白基因的克隆与序列分析

以犬瘟热病毒水貂分离株RNA为模板,经RT-PCR反应,扩增出融合蛋白基因的1053bp DNA片段,通过T-A克隆技术,成功构建克隆载体PMD-18T/F。序列分析表明:分离株与01-2689株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、00-2601株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.3%、93.5%、94.4%、93.6%9、5.3%、97.3%和94.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%、96.6%、97.4%、97.4%、97.4%、97.2%和98.0%。抗原指数分析表明分离株与疫苗ONP株、强毒A75-17株在40-50位氨基酸间存在明显差异。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析

为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

马铃薯Y病毒的RT—PCR检测

通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA,然后针对PVY~N的CP基因序列,设计合成了一对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增,结果得到与预期大小相一致的780bp片段,而对照未得到任何产物,从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径,并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。