己烯雌酚酶联免疫检测方法的建立

建立灵敏度高和特异性强的己烯雌酚残留检测分析方法。用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔,获取高效价抗体。纯化抗体经生物素标记,可同辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素特异结合。采用纯化的抗体包被96孔板,形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后,再加入生物素标记抗体,以酶标记亲和素作为探针,经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线。该方法检测灵敏度为0.125 ng/mL,可定量检测范围为0.25~15.60 ng/mL。该方法操作简便,具有较强灵敏度和特异性,可满足实践中一般样品的残留检测。     

己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备

以己烯雌酚(DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA)等为主要原料,采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将半抗原己烯雌酚与载体蛋白BSA联接制备成人工免疫原。用此免疫原免疫家兔,并以间接ELISA法测定抗体效价。结果表明,人工合成的抗原具有很强的免疫原性,被免疫兔血清中的抗DES抗体效价高达28。本试验为下一步制备抗DES单克隆抗体及研制快速检测DES残留的免疫试剂盒奠定了基础。     

农药吡虫啉酶联免疫检测方法研究进展

对目前国内外应用于吡虫啉检测的酶联免疫检测方法进行综述,论述了该方法建立过程中主要技术环节及其主要进展,以及目前市场上吡虫啉农残酶联免疫检测试剂盒,并展望该技术的应用前景。     

己烯雌酚抗原合成以及小分子微阵列检测技术研究

研究和比较了混合酸酐法和碳化二亚胺（EDC）法合成己烯雌酚（DES）全抗原的2种方法,分析了溶剂在全抗原偶联过程中的影响。以混合酸酐法合成的DES—BSA为探针制作小分子芯片,确定了最佳反应体系,并对体系稳定性做了研究,可实现时己烯雌酚残留的高通量检测。     

一种呋喃西林酶联免疫检测方法的建立

[目的]建立一种饲料中呋喃西林酶联免疫检测方法。[方法]利用制备的人工抗原和高特异性单克隆抗体,采用间接竞争酶联免疫技术建立呋喃西林检测方法。[结果]在优化条件下,检测抗原浓度为10μg/mL,抗体稀释度为1∶5 000。呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有较好的线性关系(R~2=0.998 7),IC_(50)为1.43 ng/mL。与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率低于0.5%。饲料样品中添加呋喃西林的平均回收率为87.5%～96.0%,变异系数为6.1%～9.7%。[结论]该方法快速、准确、灵敏,可用于饲料中呋喃西林的分析检测。     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

二氯喹啉酸人工抗原的合成

以3,7-二氯-8-喹啉羧酸、草酰氯、5-氨基戊酸(Q-5)为原料合成二氯喹啉酸半抗原,再采用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白[牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)]偶联合成相应的人工抗原。将半抗原用红外(IR)和核磁共振(1H-NMR)进行结构表征,通过紫外扫描证明二氯喹啉酸人工抗原(Q-5-BSA、Q-5-OVA)合成成功,且Q-5-BSA、Q-5-OVA的结合比分别为21∶1、17∶1。人工抗原的合成为研制二氯喹啉酸多克隆抗体及免疫试剂盒奠定了基础。     

酶催化氧化法处理水中的己烯雌酚

研究用辣根过氧化物酶(HRP)催化氧化法处理水中己烯雌酚(DES)的适宜工艺反应条件。试验考察了反应温度、p H和反应物反应计量比等对DES去除率的影响。结果显示,在p H4.5、25℃、[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol和MH2 O2∶MDES(反应摩尔比)为1∶2的反应条件下,反应3 h,DES去除率可达到92.08%。研究表明,HRP催化H2O2氧化DES反应的适宜条件是:p H4.5左右,温度25℃左右,[HRP]0/[DES]0为1.000 U/μmol,MH2 O2:MDES宜大于0.5;过量H2O2抑制HRP催化活性;DES起始浓度越高,其去除速率越大;以底物DES去除速率表示的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为74.63 mmol/(L·h)和46.75 mmol/L。     

诺氟沙星人工抗原的合成

采用碳二亚胺(EDC)法将诺氟沙星(NFLX)分别与载体蛋白BSA和OVA进行偶联。用于制备免疫抗原NFLX-BSA和包被抗原NFLX-OVA。通过对产物进行紫外扫描和SDS-PAGE,证明半抗原与载体偶联成功。以免疫原NFLX-BSA免疫BALB/C小鼠45 d后,通过间接ELISA方法检测效价达1:32 000。这一结果为进一步制备抗NFLX单克隆抗体提供了良好的免疫原。     

渭北烟区黄瓜花叶病毒酶联免疫检测方法

将采自渭北烟田的黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离纯化后,制备抗血清并建立了双抗体夹心式酶联免疫检测方法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）,同时对其各项指标作了合理选择,结果发现最适包被和酶标抗体的质量浓度均为０．６２５ｍｇ·Ｌ－１．用此方法测定表明,在渭北烟区越冬油菜是ＣＭＶ的主要越冬寄主;ＣＭＶ侵染烟草所引起的花叶病约占６４．３％．     

硫代磷酸酯类农药通用抗原的合成与鉴定

【目的】合成具有硫代磷酸酯类农药共性结构的系列半抗原,制备此类农药的通用人工抗原。【方法】以烷氧基硫代磷酸盐和卤代羧酸为原料合成半抗原,采用¹HNMR、¹³CNMR及EIS-MS谱图对其结构进行表征。将合成的半抗原分别通过活性酯法、混合酸酐法与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联,制备免疫人工抗原和包被人工抗原。用紫外扫描法定性分析人工抗原的偶联情况,用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法间接测定其偶联比。【结果】合成了H1～H6 6种具有硫代磷酸酯类农药共性结构的半抗原,其中H1、H2为包被半抗原,H3～H6为免疫半抗原。制备了H1-OVA、H2-OVA、H3-BSA、H4-BSA、H5-BSA、H6-BSA、H2-BSA、H4-OVA和H6-OVA 9种人工抗原,其偶联比分别为9∶1、10∶1、23∶1、26∶1、39∶1、43∶1、28∶1、14∶1和12∶1。【结论】成功合成硫代磷酸酯类农药的人工抗原,为下一步用其免疫动物制备抗体进而进行有机磷农药酶联免疫分析奠定了基础。     

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphniamagna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirectandnon‐competitiveenzyme‐linkedimmunosorbentassay).结果表明:此方法检测灵敏度为24ng爛mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg爛mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0畅25%、<0畅25%、 2畅13%、 10畅19%、3畅88%、 3畅56%、 2畅81%、 3畅93%、 5畅00%和2畅75%,具较高的特异性.说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测.     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

抗麦草畏多克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立麦草畏的免疫分析方法,采用碳化二亚胺法将麦草畏(DIC)与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,分别合成免疫原与包被原;用合成的免疫原免疫新西兰大白兔获得抗麦草畏多克隆抗体,该抗体效价为1∶1.28×105,且该抗体与麦草畏的结构类似物2,3,5-三氯苯甲酸、2,3,6-三氯苯甲酸、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸的交叉反应率均小于0.1%。以包被原1∶8 000和多抗溶液1∶80 000的稀释倍数为工作浓度,建立麦草畏间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法,此方法检测麦草畏的线性范围为1～100ng.mL-1,线性回归方程为y=8.684 4ln x+15.001,R2=0.994 4,最低检测限为IC20=1.779ng.mL-1;玉米粉和面粉空白样品的麦草畏添加回收实验表明,麦草畏添加值为5～30μg.kg-1时,玉米粉中的麦草畏回收率为53.08%～92.37%,面粉的回收率则分别为66.5%～94.63%。     

Development of Anti-Isoproturon Polyclonal Antibody

A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) suitable for the determination of the urea herbicide isoproturon,3-(4-isopropylphenyl)-1,1-dimethylurea, in food and environmental samples was developed. Two haptens named 1-(3-carboxypropyl)-3-(4-isopropylphenyl)-1-methylurca (hapten 4C) and 1-(5-carboxypentyl)-3-(4-isopropylphenyl)-1-methylurea (hapten 6C) were synthesized. The haptens were coupled to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin(OVA), respectively, using the N-hydroxysuccinimide reaction. The hapten 6C-BSA conjugate was used as the immunogen,with which a high-titer anti-isoproturon polyclonal antibody (pAb) was successfully obtained by immunization of New Zealand white rabbits. The hapten 4C-OVA conjugate was used as coating antigen and a method of the indirect competitive ELISA for isoproturon was established. The haptens were confirmed with TLC, IR, and 1H NMR. The conjugation molar ratios of hapten 4C to OVA and hapten 6C to BSA were 36:1 and 46:1, respectively, as calculated by a UV spectrophotometry.The highest titer of the anti-isoproturon sera determined by a non-competitive indirect ELISA procedure was 1.6×105. The optimal concentrations of the coating antigen and the dilution of the anti-isoproturon sera used in the ELISA were 0.1 mg L-1 and 1.0 × 105, respectively. The concentration of isoproturon that inhibits 50% of antibody-antigen binding (IC50) was 0.07 mg mL-1.The cross-reactivities of six urea herbicides including chlorbromuron, fluometuron, monolinuron were lower than 0.1%. Isoproturon is a small molecule without immune activity and active functional group for attaching to carrier protein. To produce an antibody against isoproturon with high titer and high specificity is the most important step in the development of an immunochemical method for the determination of isoproturon in food and environmental samples. The two haptens synthesized in this study have carboxyl groups and accommodate different lengths of spacer arms, and the phenyl and isopropyl groups are fully exposed. An anti-isoproturon polyclonal antibody with high titer and high specificity was successfully obtained by immunization of rabbits with the conjugate of the hapten attached to the protein carrier.     

拟除虫菊酯类农药半抗原合成及酶联免疫分析

酶联免疫分析(ELISA)是农药残留检测的一种重要方法,具有方便快速、特异灵敏等优点.主要介绍了拟除虫菊酯类农药半抗原的合成方法,对拟除虫菊酯分子的环丙烷、氰基和芳香环进行修饰;对拟除虫菊酯水解产物进行修饰;增加一个连接臂作为半抗原.同时介绍了酶联免疫分析的研究进展,对拟除虫菊酯类农药半抗原的合成及酶联免疫分析进行了讨论和展望.酶联免疫分析在拟除虫菊酯类农药的残留检测中将起到越来越重要的作用.     

褐飞虱抗原检测最佳ELISA条件的建立

应用褐飞虱单克隆抗体3B2和4B8比较了直接、间接和多种抗体夹心ELISA方法.结果表明:当拟环纹豹蛛稀释512倍(含拟环纹豹蛛0.04 mg/mL)时,直接和间接ELISA的OD值比阳性对照仍降低5%以上.而当捕食者稀释100倍时,对同种单抗、异种单抗和两种单抗混合夹心ELISA检测OD值的影响均小于5%.在加入100倍豹蛛稀释液时,3种抗体夹心ELISA检测灵敏度均为16.90 ng/mL(1/17509头褐飞虱雌成虫),直接和间接ELISA分别为:67.59 ng/mL (1/4378头)和135.18 ng/mL (1/2189头).建立了4B8稀释1000倍(28.13 μg/mL),捕食者匀浆液定容至1 mL/头后再稀释100倍,HRP-4B8稀释4000倍(1.04 μg/mL)的夹心ELISA用于检测捕食者肠道中的褐飞虱抗原.在此系统下,检测灵敏度为每头拟环纹豹蛛含1.69 μg猎物蛋白(1/175头褐飞虱雌成虫),非目标抗原的影响小于5%.     

驼源莠去津多克隆抗体的制备及间接竞争酶联免疫吸附分析方法的建立

为构建莠去津的快速监测技术,本试验通过美洲驼免疫,成功建立了基于美洲驼多克隆抗体的莠去津的酶联免疫检测方法,通过棋盘法确定了最佳包被抗原和抗血清稀释倍数,对影响反应的关键因素进行了优化,并进行了交叉反应性试验和添加回收试验。结果表明：通过优化反应体系,确定最优NaCl浓度为0.2 mol/L,最优甲醇浓度为5%,最佳缓冲液pH值为7.4,在最优条件下,间接竞争酶联免疫分析法的IC50为12.13 ng/mL;同时利用其他3种三氮苯类除草剂及常见环境代谢物进行了多克隆抗体的特异性试验,其对特丁津、西玛津和对去异丙基莠去津的交叉反应率较高,其他化合物交叉反应率较低;取河流水进行了实际样品的添加回收试验,试验结果与LC-MS比对,添加回收率在90.1%～114.2%之间,说明驼源多克隆抗体的莠去津间接竞争酶联免疫吸附分析方法可用于检测环境实际样品。     

金银染色三抗体夹心法检测兔出血症病毒(RHDV)抗原

成功地建立了检测兔出血症病毒(RHDV)抗原的金银染色(SECGA)三抗体夹心法,并确定了试验流程中鼠抗RHDV-IgG(110)、兔抗RHDV-IgG(1160)、金标羊抗兔IgG(150)等三项的最佳工作浓度及最适显影时间(20 min).实验结果表明,本法除了具有Dot-ELISA的高度特异性外,还具有抗原量少、敏感性高、不参与3,3-二氨基联苯胺盐酸盐等有害物质、实验结果更可靠等优点,适合于现场推广应用,并为兔出血症的诊断提供可靠的实验手段.     

伪狂犬病毒重组gG抗原片段的原核表达及其间接酶联免疫吸附测定方法的建立

[目的]建立方便可行的伪狂犬病毒血清抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异性鉴别伪狂犬病毒TK-/gG基因缺失疫苗免疫株和野毒株.[方法]利用原核表达系统表达伪狂犬病毒gG抗原片段,蛋白纯化后包被,优化反应条件,建立一种用于检测伪狂犬病毒gG抗体的间接酶联免疫吸附测定方法.[结果]通过不同血清样品的检测试验,该酶联免疫吸附测定方法可以鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫猪和感染野毒的血清学阳性猪.[结论]成功建立了检测伪狂犬病毒gG抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫株和野毒株,此方法敏感性强,特异性高,操作简便,适合于临床大量检测.